不同培养条件对分蘖洋葱茎尖脱毒效果的影响

王健鹂 张 悦 王秀峰 聂楚楚 马艺荞 王学国

（吉林省蔬菜花卉科学研究院， 长春 130033）

分蘖洋葱作为吉林省非常重要的优势蔬菜品种之一，对农业经济发展起到了积极的促进作用[1]。分蘖洋葱极少抽薹开花，有性繁殖困难，主要以鳞茎作为繁殖器官[2]。长期无性繁殖导致一种或几种病毒复合侵染，致使植株矮小，生长势弱，产量和品质大幅降低，品种退化严重，极大地制约了分蘖洋葱产业健康发展。采用茎尖脱毒的方法能够有效的去除分蘖洋葱所携带的病毒，但是由于茎尖剥离体积较小，成活率较低，操作较为烦琐，限制了分蘖洋葱脱毒种苗的繁育与推广。因此，急需一种行之有效的方法为分蘖洋葱脱毒[3]及良种繁育工作铺平道路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料来源吉林省农安县（NA）、公主岭市（HD）及延边州（HC）地方分蘖洋葱品种，部分经检测含有洋葱黄矮病毒。

1.2 试验方法

1.2.1 分蘖洋葱茎尖脱毒培养体系的建立

（1）无菌外植体的制备 分蘖洋葱种球于4℃低温处理7～10 d，打破休眠后将分蘖洋葱种球外层鳞茎逐层剥下，外植体剥至2 cm大小左右，流水冲洗2 h，将小鳞茎用75%乙醇消毒1 min，放入1%次氯酸钠溶液杀菌消毒10～15 min，再用大量无菌水冲洗3～5次后备用。

（2）茎尖启动培养基的筛选 在无菌条件下，利用体式显微镜剥离茎尖分生组织，尺寸大致为0.3 mm左右。将剥离的茎尖分别置于3种不同茎尖分生组织启动培养基中（表1），于20℃、2000 lux、16 h/d光照时长的条件下培养，比较成活率、分化芽数、植株状态等指标因素。每个处理接种个数30个，试验设3次重复。

表1 分蘖洋葱茎尖启动培养基配方

（3）生根培养基的筛选 35 d后，将茎尖外植体启动培养基生长的幼芽接种到不同的生根培养基中（表2），21 d后统计观察比较不同生根培养基的生根效率及根部生长情况。每个处理接种30个成活茎尖，试验设3次重复。

表2 分蘖洋葱生根培养基配方

1.2.2 分蘖洋葱茎尖大小与热处理对脱毒效果的影响

（1）分蘖洋葱种球热处理 将感染洋葱黄矮病毒的分蘖洋葱葱头剥除鳞茎外皮，切除顶部2/3后放入干燥箱中，分别用60℃、70℃、80℃和90℃四个温度进行处理，热处理时间为10 min。

（2）无菌外植体的制备 外植体剥至1 cm大小左右，流水冲洗4 h，将小鳞茎用75%乙醇消毒30 s，置入1%次氯酸钠溶液杀菌消毒10～15 min，再用大量无菌水冲洗3～5次后备用。

（3）不同茎尖处理的茎尖培养 于超净台中剥离分蘖洋葱茎尖，茎尖大小分为2个级别：小于0.5 mm和0.5～1.0 mm（表3）。利用之前筛选出的分蘖洋葱茎尖培养基及培养条件进行培养，比较茎尖的成活率，每个处理剥离30个茎尖，3次重复。

表3 分蘖洋葱鳞茎热处理及脱毒茎尖大小

2 结果与分析

2.1 分蘖洋葱茎尖脱毒培养体系的建立

2.1.1 不同品种茎尖启动培养基的筛选 将剥离的品种NA、HD、HC的茎尖置于3种不同茎尖分生组织启动培养基中（图1），35 d后统计成活率、分化芽数、植株状态等（表4）。试验结果表明，培养基的成分对茎尖的生长起决定作用，相同培养基对不同品种之间的影响无明显差异。

本试验的3个地方品种在MS + NAA 0.1mg/L + zip 0.4 mg/L中的成活率在80%左右；在MS +IAA 0.1 mg/L + 6-BA 0.4 mg/L中成活率在60%左右；在MS + NAA 0.025 mg/L + 6-BA 0.1 mg/L +GA3 0.05 mg/L的成活率均最低，在40%左右。在分化芽数上，茎尖在MS + NAA 0.1mg/L + zip 0.4 mg/L的培养基中的平均分化芽数均较其他2个培养基中的高。在植株状态上，从测定的株高和茎粗可见，MS + NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L培养基中的植株，在株高和茎粗方面均最高，株高可达3 cm以上，茎粗达1 cm以上。无论从成活率、分化芽数还是植株状态上，都可以看出MS + NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L培养基均优于其他2个培养基，因此确定该培养基为最适茎尖启动培养基。

2.1.2 不同品种生根培养基的筛选 将成活的茎尖幼芽接种到不同的生根培养基中，3周后统计观察比较不同生根培养基的生根效率及根部生长情况（图2）。

图1 不同启动培养基对分蘖洋葱茎尖培养情况

表4 不同品种在不同启动培养基上的茎尖成活及茎尖生长情况

图2 分蘖洋葱茎尖脱毒苗在不同生根培养基上的生长情况

试验结果表明（表5），1/2 MS + NAA 0.1 mg/L的生根培养基生根率最高，均达100%，且根的形态均为根数极多且长，根毛多，植株生长势强，整齐强壮，植株浓绿；3个品种对不同生根培养基的响应无差异，3个品种在1/2 MS + NAA 0.1 mg/L生根培养基中均表现生根率高、根的形态好、植株形态好等。由此可见，1/2 MS + NAA 0.1 mg/L为最适生根培养基。

通过对比吉林省农安县(NA)、公主岭市(HD)及延边州(HC)市售的优质商品种球茎尖在不同启动培养基及生根培养基的响应情况（图3），最终建立一套高效的分蘖洋葱茎尖脱毒培养体系，即茎尖启动培养基为MS+NAA 0.1 mg/L + zip 0.4 mg/L，生根培养基为1/2 MS + NAA 0.1 mg/L。且不同品种这套茎尖脱毒培养体系中的响应无差异，证明此茎尖脱毒培养体系的应用性较强，范围较广。

表5 不同品种在不同生根培养基上的生根生长情况

2.2 分蘖洋葱茎尖大小与热处理对脱毒效果的影响

将鳞茎先进行热处理，然后在切取小于0.5 mm和0.5～1.0 mm两种规格的茎尖，进行培养。待成苗后，剪取叶片利用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法 （DAS-ELISA）检测脱毒效果。

试验结果表明（表6），在不同温度处理下，茎尖小于0.5 mm的成活率明显低于茎尖大于0.5 mm的成活率，说明茎尖大小与成活率正相关；茎尖在小于0.5 mm的脱毒率明显高于茎尖大于0.5 mm的脱毒率，说明茎尖大小与脱毒率负相关。随着处理温度的升高，成活率呈下降趋势；但随着处理温度的升高，脱毒率呈上升趋势。在80℃热处理10 min后，茎尖大小在0.5～1.0 mm时，脱毒率效果最佳可达96.7%。

图3 不同时期分蘖洋葱脱毒茎尖生长情况

2.3 不同品种对热处理结合茎尖大小脱毒效果的比较

对农安县（NA）、公主岭市（HD）及延边州（HC）市售的优质商品种球进行80℃处理10 min后，剥取0.5～1.0 mm的茎尖进行诱导，比较成活率及脱毒率。

试验结果可见（表7），不同品种处理后成活率均在90%以上，脱毒率也均在93.3%以上。

表6 不同热处理结合茎尖培养脱毒效果比较

表7 不同品种对茎尖热处理脱毒效果比较

2.4 茎尖脱毒种球对产量的影响

利用脱毒苗生产分蘖洋葱种球，翌年种植后田间植株长势较强，未发现病毒病发病情况，其生长期相对延长，种性恢复较好（图4），每667 m2平均产量提高12.36%（表8）。

表8 不同分蘖洋葱品种脱毒前后产量比较

3 讨论

3.1 不同分蘖洋葱品种对启动培养基的适应性

通常情况下，同一作物的不同品种因其基因型不同对激素的敏感度不同，所以在组织培养过程中，对同一作物的不同品种通常会采用不同的激素配比。考虑到吉林省内分蘖洋葱品种的多样性，本试验在不同生产区域分别采集了3种不同的分蘖洋葱地方品种，其目的在于考察不同分蘖洋葱品种对不同培养基的适应性。但试验结果证明，吉林省内不同品种的分蘖洋葱对不同培养基有相同的适应性，导致这一结果的可能性应该是样本采集的区域跨度不够大，都是在吉林省内采集的样本，其存在一定的亲缘关系。

图4 分蘖洋葱茎尖脱毒培养对种性恢复的田间表现注：a.为未脱毒分蘖洋葱；b.为脱毒分蘖洋葱。

3.2 热处理茎尖剥离大小结合方法的优越性

一般情况下，利用茎尖脱毒培养可有效地将植物体内的病毒脱离，但由于葱属植物的生长点被一层层的鳞茎鞘包裹加之茎尖多汁，致使葱属植物的茎尖脱毒面临剥离困难、工作量大的缺点，这些都在一定程度上限制了葱属茎尖脱毒培养的应用。本研究应用热处理结合控制茎尖大小的手段，将茎尖剥离大小由通用的0.1～0.3 mm提高到了0.5～1.0 mm，经DAS-ELISA检测脱毒率可达96.9%，极大地降低剥离茎尖的难度，提高工作效率，为分蘖洋葱脱毒种苗的工厂化生产奠定了基础。

3.3 分蘖洋葱脱毒种苗的市场前景

分蘖洋葱脱毒种球通过田间种植，相比未脱毒处理，其产量提高12%以上，证明脱毒对种性具有较强的恢复作用。分蘖洋葱脱毒新品种的推广应用，将显著提高产品质量和产量，创造出较大经济效益，可促进分蘖洋葱优势蔬菜产业健康、可持续发展。

[1] 赵靖. 分蘖洋葱产量形成机理及调控技术的研究[D].长春: 吉林农业大学, 2014

[2] 王巨媛. 洋葱营养生长时期生育规律的研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2001

[3] 徐启江, 陈典,张云修. 分蘖洋葱茎尖培养脱毒苗技术研究[J]. 西北农林科技大学学报, 2002(2): 101–106