Lumican对角膜SLRPs家族成员及角膜透明性的影响

来凌波，张丰菊

(首都医科大学附属北京同仁医院 北京同仁眼科中心 北京市眼科学与视觉科学重点实验室，北京100730)



综 述

Lumican对角膜SLRPs家族成员及角膜透明性的影响

来凌波，张丰菊

(首都医科大学附属北京同仁医院 北京同仁眼科中心 北京市眼科学与视觉科学重点实验室，北京100730)

Lumican作为小分子亮氨酸重复蛋白聚糖(SLRPs)中的主要成员，在角膜基质层生成过程中起重要作用。SLRPs大量存在于角膜基质层中，包括I型：decorin和biglycan, II型：lumican，keratocan和fibromodulin。成员之间合作调控角膜基质层原纤维的形成、成熟及装配，从而形成基质层高度有序的结构特点，这是形成和维持角膜透明性的基础。Lumican基因表达改变会影响lumican和其他细胞外基质成分在角膜中的正常比例和排列关系，影响细胞外基质间的相互作用，进而导致胶原原纤维形成和成熟异常，最终造成角膜基质层混浊。

lumican；小分子亮氨酸蛋白聚糖(SLRPs)；角膜基质层；胶原原纤维

眼角膜是一种特异的无血管透明结缔组织，提供眼总屈光力的75%。角膜基质层占角膜组织的90%，由水合胶原原纤维和蛋白聚糖精密协调构成高度有序的板层状结构。基质层规则的板层结构对角膜透明性至关重要。小分子亮氨酸蛋白聚糖(SLRPs)家族成员广泛存在于角膜基质中，作为最主要的细胞外基质调控角膜基质层胶原原纤维的形成和装配。SLRPs家族分I型和II型，SLRPs家族成员之间相互影响，共同参与形成角膜基质层纤维板层结构。Lumican作为含量最高的硫酸软骨素蛋白聚糖在II型SLRP中起主导作用，其表达改变会影响其他SLRPs的表达。随着转基因技术的发展，现已有多个基因敲除和转入突变基因的动物模型证明SLRPs家族成员基因的缺失或突变能够改变其他成员表达水平，最终导致角膜混浊。Lumican近年来被广泛研究，本文将就lumican与其他SLRPs成员在角膜基质层中的相互作用以及对角膜透明性的影响进行综述。

1 Lumican的概述

1.1 Lumican的结构特点

Lumican作为重要的细胞外基质，属于小分子亮氨酸蛋白聚糖(SLRPs)家族成员,广泛存在于哺乳动物全身的结缔组织中，如骨骼肌、血管平滑肌细胞、肾、胰、脑、胎盘、肝脏、心脏、皮肤、肺、结肠、动脉血管，椎间盘[1-3]。在眼组织中主要存在于角膜、巩膜、晶状体、小梁网等部分。

人类lumican基因位于12q22，lumican分子量约为40 kDa[4]，长度为338个氨基酸残基[1]。lumican包含4个结构域：(1)一个信号肽；(2)带负电荷的N端结构域；(3)富含亮氨酸的串联重复序列，其N端糖基化位点连接硫酸角质素糖胺聚糖(GAGs)，该结构在多种分子识别过程中起作用；(4)C端的50个氨基酸残基通过二硫键与32个氨基酸的半胱氨酸残基相连[1,5]。

1.2 Lumican的生物学功能

研究青光眼、高度近视、眼部炎症和眼损伤修复的动物实验证明，lumican在维持眼正常形态结构、炎症反应和疾病发展进程等方面起重要作用。Lumican首次在鸡角膜中被发现并被定义为硫酸角质素蛋白聚糖。Lumican对角膜透明性至关重要[6]，它与其他SLRPs家族成员互相协调，形成并维持严密的胶原蛋白板层结构。Lumican基因敲除[lumican(-/-)]的纯合小鼠出现双眼角膜混浊，皮肤的松弛脆弱等现象，类似Ehlers-Danlos型综合征[7]。运用透射电子显微镜研究lumican(-/-)小鼠角膜，发现胶原原纤维生长失去限制，大部分胶原原纤维直径异常增粗[8]，角膜基质层后部胶原原纤维异常明显，而前部相对没有改变。进一步运用激光共聚焦显微镜定量研究角膜混浊度，结果显示基质层散射提高40%，厚度减少40%[6]。Lumican缺失导致原纤维形成过程出现异常，原纤维直径明显增大，板层结构破环，角膜透明性改变[9]。在lumican(-/-)的新生小鼠角膜也出现以上表现[8]，表明lumican在角膜发育的初始阶段同样重要。

通过对牛角膜的研究发现，正常原纤维结构的维持依靠包含lumican在内的蛋白聚糖分子与胶原蛋白分子之间的多种分子间作用力。SLRPs的缺失或结构缺陷会导致原纤维排列杂乱无章，最终导致角膜混浊[10]。目前没有发现任何人类lumican基因单核苷酸多态性(SNPs)与角膜异常相关[11]。显然，在这方面仍需更多研究，可能对角膜疾病的认识和治疗有所帮助。

2 SLRPs参与角膜基质层形成

2.1 SLRPs的结构特点

SLRPs均由含有亮氨酸重复序列的核心蛋白和一或多个共价俩连接的糖胺聚糖(GAG)侧链构成。SLRPs的命名和分型是根据GAG侧链的类型决定的。角膜组织中GAG有三种类型：硫酸软骨素/皮肤素(CS/DS)，硫酸角质素(KS)，硫酸肝素(HS)。对牛、兔、鸡、猴和人的角膜组织中GAG进行研究发现，DS和KS占绝大部分，HS占小部分。角膜基质细胞的粗面内质网中合成核心蛋白，而后在高尔基体中GAG侧链与核心蛋白连接，组成蛋白聚糖后分泌出胞，进入细胞外基质，与细胞外基质的其他组成成分强烈的相互作用，共同参与角膜基质层的形成，对形成角膜透明性和屈光力等生物学特性十分重要。

2.2 角膜的生物学结构及特点的形成

角膜是眼前节的透明组织，其主要功能是允许光通过。角膜是眼主要的屈光结构，承担总屈光力的75%。角膜基质层占据角膜厚度的90%。基质层由富含胶原蛋白的细胞外基质(ECM)装配而成，严密规则的结构是角膜透明性和适当屈光力的基础。基质层的主要结构特征是致密的，规律组装的胶原原纤维。胶原原纤维直径大小均匀一致，约为25 nm。

角膜基质细胞负责合成和分泌细胞外基质，细胞外基质形成基质层板层结构，基质细胞位于板层间。角膜基质层形成是一个多步骤的过程[12]，由多分子相互作用共同调控。包括：能构成原纤维的胶原蛋白分子(主要为I型和V型)、SLRPs、以及FACIT胶原蛋白。最初，基质细胞分泌I型和V型胶原，胶原蛋白分子在基质细胞表面形成异型前原纤维。然后，FACITs与异形前原纤维相互作用，调控其包装。与此同时，SLRPs结合到前原纤维表面调控其直线和方向横向的生长，前原纤维在SLRPs监控下以头尾相连和横向连接的方式组装形成成熟的胶原原纤维，这一过程被称为“角膜限制”，原纤维直径大小受限[13]。原纤维规律包装成捆状，成为胶原纤维。胶原纤维合并堆积成层，成为板层结构。SLRPs不仅能限制原纤维的直径，还能控制原纤维之间的空间分布，保证最终形成的板层结构的致密性。过去普遍认为邻近板层间大约成正交关系，即90°。然而在不同物种和不同的基质层部位中发现，相邻板层可呈1°～90°分布[14]。大部分的板层与相邻板层相抵消，形成胶合板样结构。根据光的物理性质，规律堆叠的角膜基质薄层状结构产生最小的散光，保证角膜的透明性。

3 Lumican对其他SLRPs成员的影响

角膜组织中I型SLRPs包括decorin和biglycan，II型SLRP包括lumican,keratocan，fibromodulin。既往建立了这5种基因的单基因敲除小鼠模型，结果显示均出现了异常的结缔组织表型[15-16]。

II型SLRP在角膜基质层发育过程中显示出时间和空间的表达差异。新生小鼠角膜基质层lumican与keratocan均匀存在，但是在角膜发育成熟后，lumican便局限在基质层后部表达而keratocan保持均匀分布[15,17-18]。Fibromodulin在出生后第14天在中央角膜基质层表达最强，但在角膜成熟过程中表达减少并局限在角膜周边[18]，在成熟角膜基质层中几乎不存在。在lumican(-/-)小鼠中，keratocan表达下降，fibromodulin表达上升。原纤维结构改变和直径增大在角膜基质层后部较前部明显[15]，与lumincan表达部位一致。Keratocan(-/-)小鼠角膜轻度变薄但透明性未受影响，持续观察12个月仍未发现角膜混浊[19]。

SLRPs对调节角膜基质层的胶原原纤维形成和基质装配起至关重要的作用。Decorin和lumican起主导作用，biglycan和keratocan、fibromodulin起辅助调控作用[20]。与角膜组织不同，在心脏和主动脉结缔组织中，biglycan对调控胶原原纤维装配起主导作用[21-22]。在肌腱和巩膜组织中，fibromodulin起主导作用，lumican辅助调整其调控功能。

Chen S等[23]建立了lumican(-/-)小鼠,biglycan(-/-)小鼠，lumican(-/-)联合biglycan(-/-)小鼠模型，野生型小鼠作为对照组对角膜组织进行研究。结果显示：lumican(-/-)小鼠角膜混浊明显并且集中在基质层后部，角膜厚度变薄，但与野生型相比差异无统计学意义。Biglycan(-/-)小鼠角膜组织的透明度和厚度与野生型小鼠基本相同。Lumican(-/-)联合biglycan(-/-)小鼠角膜混浊比lumican(-/-)小鼠严重并且在基质层全层出现，角膜明显变薄且差异具有统计学意义。透射电子显微镜显示角膜基质层原纤微结构异常以及基质层板层结构破坏。联合基因敲除小鼠角膜形态功能异常比单基因敲除小鼠严重得多，甚至比单基因敲除的异常表型的总和还要严重。这表明在角膜基质中lumican和biglycan之间存在相互作用关系。Chen S等[24]建立突变decorinC端缩短转基因小鼠模型，研究常染色体显性遗传的先天性角膜基质营养不良(CDSC)的病理生理机制。成熟的突变decorin转基因小鼠与野生型小鼠相比，自身的decorin和biglycan表达下降。位于基质层后部lumican表达明显下降，keratocan表达下降，fibromodulin显著上升，该基因在成熟野生型小鼠角膜基质层中几乎不表达。这种SLRPs表达方式导致基质层中蛋白质之间相互作用异常，SLRPs对胶原原纤维形成和组装控制不良,从而导致角膜基质层的板层结构异常，最终表现为角膜混浊。在decorinC端缩短的转基因小鼠中，结构改变和功能缺失的表现贯穿角膜基质层并且在后部基质层更加严重，这种现象与lumican(-/-)小鼠的角膜异常表型相符，CSCD的异常表现部分是lumican表达下降导致的[15]。所以，CSCD的异常表型不仅与decorin突变相关，还与decorin基因突变造成的其他SLRPs成员表达异常相关。

SLRPs参与角膜基质层的发育，损伤修复和组织重塑，此外还与多种眼部异常相关。Decorin基因突变与人类先天性角膜基质营养不良相关，keratocan纯合和复合杂合基因突变可导致扁平角膜，表现为角膜曲率降低、角膜混浊及角膜缘混浊，现已发现11个keratocan基因突变位点与该病相关[25-26]，lumican基因突变与人类高度近视相关[27-28]。

4 Lumican影响其他SLRPs表达的分子生物学基础

SLRPs主要通过亮氨酸重复序列与胶原原纤维连接。I型和II型的SLRPs连接胶原原纤维的不同位点，I型：decorin和biglycan连接原纤维的b和d区域[29],II型：lumican和fibromodulin连接a和c区域[30]。

Carlson EC等[31]通过比较野生型lumican(+/+)小鼠，lumican(+ / -)小鼠和lumican(- / -)小鼠的keratocan表达水平发现：keratocan表达随着lumican表达的减少而递减。相反的，keratocan(-/-)小鼠角膜基质，没有发现包括lumican在内的其他SLRPs家族成员表达改变。Lumican(-/-)小鼠出现角膜混浊、变薄，皮肤脆弱，角膜受损后上皮细胞迁移能力及多核型白细胞聚集能力减弱，伤口愈合延迟[32]，晶状体损伤后上皮-间充质细胞转换延迟[33]。Lumican(-/-)小鼠的角膜异常表型也许不仅是缺乏lumican的结果，可能还与keratocan表达显著降低有关。体外实验中，用小分子干扰RNA破坏lumican表达，结果显示keratocan表达下降。Keratocan和lumican的启动子有89%的同源性。在lumican(-/-)小鼠加入能被keratocan启动子驱动表达的含有β半乳糖苷酶的lumican微小基因后keratocan转录活性提升。这些研究结果表明,lumican基因在转录水平调控keratocan基因表达。实验者在野生型小鼠中转入过量lumican基因，并未发现角膜胶原蛋白结构透明度改变，keratocan在mRNA和蛋白质水平均上调。提示了过量的KSPG(硫酸角质素蛋白聚糖)对角膜的正常形态无不利影响。Lumican(-/-)小鼠中lumican和keratocan表达均减少。提示正常角膜形态的形成需要最小有效浓度的KSPG，而严格的KSPG和胶原蛋白比例不是必要的，KSPG过表达无害[31]。KSPG与胶原蛋白分子的结合位点数量有限也许可以部分解释这一现象。

在对小鼠肌腱组织的研究发现，lumican和fibromodulin竞争结合I型胶原蛋白的同一位点[34]。Lumican和fibromodulin的同源序列亮氨酸重复序列7(LRR7)负责调控二者与胶原蛋白的结合。在小鼠肌腱组织中，fibromodulin占主导地位。Lumican(-/-)小鼠肌腱原纤维基本正常，而fibromodulin(-/-)小鼠原纤维形成破坏，lumican的表达是对照组野生型小鼠的4倍[35]。Fmod 5-7片段中251位谷氨酸突变为谷氨酰胺后丧失了抑制lumican连接胶原蛋白的能力。Fibromodulin基因敲除后更多的lumican连接在胶原蛋白空闲的位点上。不同的SLRPs组合在一起可能将胶原蛋白分子塑造成特异的基质网络结构，比如肌腱和角膜。这可能是通过绑定到不同或相同的胶原蛋白区域造成的。

5 小结与展望

SLRPs作为角膜基质层重要组成部分，在角膜基质层原纤维的形成，成熟，基质层的装配过程中起重要调控作用。SLRPs家族成员之间相互作用既有竞争关系又相互协作。Lumican作为SLRPs中的主要成员，对角膜透明性的形成和维持非常重要。动物实验已证实其表达水平的变化改变会对其他SLRPs和角膜组织形态产生影响。但是lumican与其他SLRPs家族成员相互作用的分子机制仍有待研究。现已有证据显示lumican基因突变或表达水平改变与包括高度近视在内的多种眼部异常相关。但其分子机制尚不明确，有可能是改变了lumican与其他细胞外机制分子之间的物理连接，也有可能通过影响细胞表面受体影响信号传导通路。Lumican与眼部多种生理及病理过程相关，研究其作用的分子机制协助临床对疾病的深入理解具有积极的意义。

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Effect of lumican expression on the SLRPs family and corneal transparency

LAI Lingbo,ZHANG Fengju

(BeijingTongrenEyeCenter，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，BeijingOphthalmology&VisualSciencesKeyLaboratory，Beijing10073，China)

Lumican is the major small leucine-rich proteoglycans (SLRPs) which is vital for corneal stroma formation. The corneal stroma is enriched in small leucine-rich proteoglycans (SLRPs), including both class I (decorin and biglycan) and class II (lumican, keratocan and fibromodulin). Cooperative interclass SLRPs interactions are involved in the regulation of stromal fibrillogenesis，fiibril maturation and matrix assembly, which result in the highly organized and specific structural features in cornea. Transparency is dependent on the assembly and maintenance of a hierarchical stromal organization. Lumican expression changing will interact the rest of SLRPs expression, which lead to a dysregulated control of fibrillogenesis and fibril organization, thus the opacity of cornea stroma.

lumican；small leucine-rich proteoglycans(SLRPs)；corneal stroma；fibril

国家自然科学基金项目(81570877，81271041)

来凌波(1992-)，女，硕士研究生。E-mail：bobosc1992@sina.com

张丰菊，教授。E-mail：wxw93@hotmail.com

10.11724/jdmu.2017.03.16

R772.23

A

1671-7295(2017)03-0281-05

来凌波，张丰菊.Lumican对角膜SLRPs家族成员及角膜透明性的影响[J].大连医科大学学报，2017,39(3)：281-285.

2017-01-09；

2017-05-04)