CCK-8法检测九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

杨佳琪，檀 军，曹米兰，金道超，郭建军*

(1. 贵州大学昆虫研究所，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025; 2. 遵义医学院，贵州遵义 563099)

CCK-8法检测九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用

杨佳琪1，檀 军2，曹米兰1，金道超1，郭建军1*

(1. 贵州大学昆虫研究所，贵州山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025; 2. 遵义医学院，贵州遵义 563099)

为了明确九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用，本文利用Bradford法检测九香虫血淋巴浓度，用不同浓度的九香虫血淋巴处理体外培养的MCF-7细胞，采用CCK-8法检测九香虫血淋巴对MCF-7细胞的抑制作用。结果表明：九香虫血淋巴能显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的生长，且对MCF-7的抑制率呈时间、剂量依赖关系。

九香虫；血淋巴；乳腺癌；CCK-8法

乳腺癌严重威胁着女性健康。全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌，其长期居于女性肿瘤患者致死率的第2位；近年来我国乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势，且发病年龄逐渐降低，并且随着社会经济发展，女性生活方式显著改变，乳腺癌相关危险因素普遍存在，预计未来较长一段时间我国乳腺癌的发病率和死亡率还将持续上升(郑莹等，2013)。目前，抗乳腺癌药物对肿瘤有一定疗效，但仍存在着严重的毒副作用。因此，寻找高效、低毒、安全的抗乳腺癌药物仍是当前治疗的当务之急。

药用历史悠久的中药材九香虫AspongopuschinensisDallas, 1851是昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae昆虫(彩万志等，2001)，因其理气止痛、温中助阳的功能以及含有抗癌的药用成分而倍受人们的重视(张笠等，2011)。现代医学也认为九香虫对某些种类的肿瘤和癌症亦有良好的治疗效果(林普莲，2005；徐波等，2007)。近年来，国外研发了一种综合指标较好的细胞活性检测方法CCK-8法(Cell Counting Kit-8)，其原理为活细胞线粒体脱氢酶转化的黄色结晶为高度水溶性，不需要裂解细胞，可直接进行比色；该法步骤简便，且准确性高(Tominagaetal., 1999；熊建文等，2007；刘爱旗和夏璐，2013)，目前在国际上被广泛应用于免疫学、肿瘤学、及医用材料生物相容性等方面的研究(邹颖等，2011；辛培成等，2011；赵惠君等，2012)。因此，本实验利用Bradford法(李海玲等，2008；喻辉辉等，2010；张志涛等，2011)测得九香虫血淋巴蛋白含量后，拟采取该技术检测九香虫血淋巴对乳腺癌MCF-7的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

人乳腺癌细胞MCF-7，购自中科院上海细胞库；九香虫活虫采自贵州习水县，经贵州大学郭建军教授鉴定。

1.1.1 主要试剂

Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；DMEM(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(美国赛默飞世尔科技有限公司)；青链霉素(双抗)(索莱宝公司)；PBS缓冲液(北京鼎国昌盛生物公司)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.1.2 主要仪器设备

酶标仪(帝肯瑞士公司)；CO2培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)；生物安全柜(西班牙Telstar公司)；离心机(德国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 九香虫血淋巴制备

野外采集九香虫活虫，-20℃冰箱内致死；将其头部及翅膀掰下，剩余部分置于无针头的10 mL注射器内，挤压将九香虫体内物质与虫体分离，并向存放九香虫血淋巴的离心管中加入柠檬酸钠(0.5 mmol/L)，3500 rpm/min，4℃离心10 min，取中部的水溶性组分置于新的离心管中，制得九香虫血淋巴组分。

1.2.2 Bradford法检测九香虫蛋白浓度

完成溶解蛋白标准品，取10 μL加缓冲液PBS稀释至100 μL，使终浓度为0.5 mg/mL。将稀释后的标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，加缓冲液PBS补足到20 μL。取过滤除菌后的九香虫血淋巴10 μL加缓冲液PBS至100 μL，将稀释后的九香虫血淋巴1 μL加到96孔板中，加缓冲液PBS补足到20 μL。各孔加入200 μL G250染色液，室温放置3-5 min。用酶联免疫检测仪测定A595，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

1.2.3 癌细胞培养

将人乳腺癌MCF-7细胞体外培养于DMEM(高糖)培养基(10%胎牛血清，1%双抗)，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

1.2.4 九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7生长的影响

取指数生长期细胞，使用血细胞计数板对细胞悬液计数；将细胞悬液接种到96孔培养板中，采用倍比稀释法，调节细胞的浓度，使得浓度达到5×104个/mL，每组4孔，每孔加入细胞悬液100 μL，待细胞贴壁后，分别加入九香虫血淋巴1、5、10、15 μL(血淋巴处理组含0.5 mmol/L的柠檬酸钠)，并加入缓冲液PBS，每孔总体积补至115 μL，使得反应体系中血淋巴浓度比为1 ∶5 ∶10 ∶15，设置无药对照组(培养液中有细胞)，并对应设置空白对照组(培养液中无细胞)，在二氧化碳培养箱中37℃、5%二氧化碳浓度下分别培养12、24、36 h后取出培养板，并在96孔培养板的相应孔中加入CCK-8试剂10 μL，再将培养板重新放回二氧化碳培养孵育4 h后，利用酶联免疫检测仪在波长490 nm处测量OD值(辛培成等，2011)。抑制率的计算公式为：抑制率(%)=1-[(药物组OD值-空白对照OD值)/(无药对照组OD值-空白对照组OD值)]×100

1.3 数据处理

使用SPSS 18.0进行单因素方差分析(One way ANOVA)，试验数据以均数±标准差(X±s)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Bradford法分析测定九香虫血淋巴蛋白质含量

配置牛血清蛋白(BSA)标准品溶液0.5 mg/mL，按浓度0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL分别加到96孔板中，在595 nm下用酶联免疫检测仪测定各标准品的吸光度，重复3次，计算平均值(见表1)。

以平均吸光度(Y)对牛血清蛋白标准品含量(X)进行线性回归，得标准曲线(见图1)：Y=1.2348X+0.6240，r=0.9827(n=7)

表1 不同浓度BSA标准品吸光度

图1 牛血清蛋白标准曲线谱图Fig.1 Standard curve of BSA

在同一块酶标板上测定标准品及九香虫样品的吸光度(测定时间在1 h内完成)。九香虫血淋巴平行3份，每次试验结果测定3次，计算9次吸光度的平均值为样品最终测量值。参照标准曲线，由平均吸光度计算样品含蛋白质浓度(见表2)。

表2 九香虫血淋巴吸光度及蛋白质含量

Bradford法检测蛋白质灵敏度高，检测下限可达25 μg/mL(李海玲等，2008)，蛋白质与Bradford试剂反应颜色变化明显，颜色深浅与蛋白质含量在一定范围内呈正相关，结合酶联免疫检测仪测定可以快速检测样品中含有的蛋白质，可为后续实验中蛋白含量提供可靠依据。

2.2 CCK-8法检测九香虫血淋巴对MCF-7的抑制作用

2.2.1 作用于人乳腺癌MCF-7的九香虫血淋巴浓度

由Bradford法测出九香虫血淋巴蛋白含量，计算作用于人乳腺癌MCF-7的九香虫血淋巴浓度分别为：0.82 mg/L,4.09 mg/L,8.17 mg/L,12.26 mg/L。

2.2.2 CCK-8法检测结果

结果表明，0.82、4.09、8.17、12.26 mg/L 的九香虫血淋巴与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)，表明其对MCF-7细胞生长具有显著的抑制作用。相同时间不同浓度的血淋巴对MCF-7细胞的抑制率与对照组比较，差异显著(P<0.05)。不同时间相同浓度的血淋巴对MCF-7细胞的抑制率与对照组比较，差异达到显著水平(P<0.05)，且各浓度组对MCF-7细胞的抑制率大体随浓度的增大、时间的延长而增高，呈时间、剂量依赖关系(见表3)。

2.2.3 九香虫血淋巴对MCF-7细胞的影响

由图2可知：九香虫血淋巴对乳腺癌MCF-7细胞具有明显的抑制作用。处理时间在12-24 h时，九香虫血淋巴浓度的改变对MCF-7细胞的抑制率具有很大的影响；处理时间为24-48 h时，九香虫血淋巴浓度分别为8.17 mg/mL与12.26 mg/mL，抑制率增加的幅度明显减弱；在处理时间增至48 h后，九香虫血淋巴浓度为8.17 mg/mL与浓度12.26 mg/mL对MCF-7细胞的影响相对持平，此时九香虫血淋巴浓度的增加对MCF-7细胞的抑制率并不明显，表示这样的处理条件下，MCF-7细胞的抑制作用并不会再因血淋巴浓度的增加而增加。因此仅在一定的处理时间及九香虫血淋巴浓度范围内，对MCF-7细胞的抑制作用随着血淋巴的浓度及处理时间的增加而增强。

表3 不同浓度九香虫血淋巴作用12 h、24 h、48 h对人乳腺癌MCF-7增殖的影响

图2 九香虫血淋巴作用12 h、24 h、48 h对MCF-7细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of haemolymph from Aspongopus chinensis on proliferation of human breast cancer MCF-7 for 12,24,48 h

3 结论与讨论

据统计，中国城市人口中乳腺癌占女性恶性肿瘤之首(Zhengetal., 2010；Ferlayetal., 2010)。因此，寻找高效、低毒、安全的抗乳腺癌药物成为紧迫而现实的问题。研究表明九香虫对某些种类的肿瘤和癌症亦有良好的治疗效果，但多以干虫或冷冻干燥后的血淋巴为原料(范钦，2011；檀军等，2013)。本实验以保证九香虫血淋巴最高活性为前提，通过Bradford法检测九香虫蛋白含量，以蛋白质含量为指标，计算出各处理组九香虫血淋巴的浓度。但目前常用于检测细胞活性的MTT法，需要使用DMSO等裂解液溶解甲赞晶体，因此可能遇到颗粒不完全溶解以及吸取上清的操作中也可能带走部分细胞等问题，导致所测结果稳定性不佳等情况。所以本实验将处于对数生长期的MCF-7细胞以不同浓度的九香虫血淋巴处理后，应用CCK-8比色法检测 OD 值，计算抑制率；检测出九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖具有抑制作用，且在浓度为0.82、4.09、8.17、12.26 mg/L时呈时间和浓度依赖。

九香虫作为一种传统中药，对其抗菌作用的研究较多(吴玛莉和金道超，2005；赵柏松等，2011；李尚伟等，2015)，但其抗癌活性的研究较少。目前主要有两种研究方法，第一种是利用九香虫的提取溶剂进行抗癌活性检测，主要材料为九香虫干虫，提取方法包括有侯晓晖等(2012， 2013)使用的冷浸法得到的九香虫三氯甲烷浸提物和乙醇粗提物；于声等(2015)使用传统的水煎服药方式收集九香虫水提液，分别采用MTT法检测胃癌SGC-7901、肝癌HepG2细胞活性。第二种是檀军等(2013)直接利用九香虫活虫体内血淋巴，采用冷冻干燥等方法后加入癌细胞中，利用形态观察法及台盼蓝法检测九香虫血淋巴对胃癌SGC-7901细胞增殖影响。而以上实验表明，多种方法处理九香虫后，所得溶剂都具有一定抗癌活性，因此本实验结合两种研究方法，直接将Bradford法测得血淋巴蛋白含量后的血淋巴作用于目前高发的乳腺癌细胞内，采用比MTT法更精确的CCK-8法检测九香虫血淋巴抗癌活性，最后证明九香虫血淋巴对乳腺癌MCF-7具有明显的抑制作用。

本研究检测出九香虫血淋巴对人乳腺癌细胞具有明显的抑制作用后，可从两方面进行后续研究。一是检测九香虫血淋巴是否会诱导肿瘤细胞凋亡，进而可研究九香虫血淋巴作为抗肿瘤药物诱导细胞凋亡过程中的信号转导机制，为开发中药治疗肿瘤提供参考依据。二是针对其抗癌活性进行九香虫血淋巴的分离纯化，进一步得出九香虫血淋巴抗癌的具体活性成分，为后续药品产业化生产提供可靠支撑。

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The inhibitory effect of haemolymph fromAspongopuschinensisDallas on growth of human breast cancer MCF-7 by CCK-8

YANG Jia-Qi1, TAN Jun2, CAO Mi-Lan1, JIN Dao-Chao1, GUO Jian-Jun1*

(1. Institute of Entomology, Guizhou University, The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region, Guiyang 550025, China; 2. Zunyi Medical College, Zunyi 563099, Guizhou Province, China)

To clear the inhibitory effect on human breast cancer cell line MCF-7 by the haemolymph fromAspongopuschinensisDallas, 1851, Bradford method was used to test the concentrations of the haemolymph fromA.chinensis, the MCF-7 cells cultured in vitro were treated by different concentrations of the haemolymph, and at last the inhibition rates to MCF-7 cells were detected by CCK-8 method. The results showed that the haemolymph fromA.chinensiscould inhibit proliferation of human breast cancer MCF-7 cellsinvitrowith dosage- and time-dependent effects.

AspongopuschinensisDallas; haemolymph; breast cancer; CCK-8

国家自然科学基金(81360612)；贵州省科学基金省校联合项目(黔科合LH字[2014]7650)；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目(黔科合人字[2015]25号)；贵州省科技厅创新人才团队建设项目(黔科合人才团队[2014]4001号)

杨佳琪，女，1992年生，硕士研究生，研究方向为资源昆虫学

*通讯作者Author for correspondence，E-mail: jjguo@gzu.edu.cn

Received：2016-05-28； 接受日期Accepted: 2016-10-08

Q965.9;R273

A

1674-0858(2017)01-0193-06

杨佳琪，檀军，曹米兰，等.CCK-8法检测九香虫血淋巴对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用[J].环境昆虫学报，2017,39(1):193-197.