MMP9、S100A10基因沉默稳转小鼠细胞系的构建及验证

陈雪雯 朱红梅 温海

(上海市长征医院皮肤科 全军真菌病重点实验室 上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

·论著·

MMP9、S100A10基因沉默稳转小鼠细胞系的构建及验证

陈雪雯 朱红梅 温海

(上海市长征医院皮肤科 全军真菌病重点实验室 上海市医学真菌分子生物学重点实验室，上海 200003)

目的 分别构建小鼠MMP9、S100A10沉默的稳转细胞系，并验证功能。方法 构建能有效干扰S100A10、MMP-9表达的慢病毒LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA，将其转染293T 细胞进行包装、扩增及质量检测。将包装好的慢病毒分别转染b.End3，嘌呤霉素筛选稳转细胞系，通过荧光显微镜、RT-qPCR检测对应目的基因表达量,构建稳转细胞系。结果 成功构建有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系，其滴度分别为1×108TU/mL、3×108TU/mL。荧光显微镜检测稳转细胞的荧光表达接近100%；RT-qPCR分别检测MMP9、S100A10基因表达下调率分别为78%、72%。结论 构建有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系，为控制单一变量直观探究S100A10、MMP-9影响隐球菌穿过血脑屏障的能力等研究奠定了重要基础，为隐球菌性脑炎/脑膜炎的临床治疗靶点研究开辟新的思路。

慢病毒载体；基质金属蛋白酶9 (MMP9)；S100A10；b.End3

隐球菌病是目前最严重的真菌感染疾病之一，全球每年大概有数百万人群感染该菌致病，即使治疗3个月仍有624 700例患者死亡[1]。隐球菌有很强的嗜中枢神经特性[2-5]，中枢神经系统感染占以上[6]，由其导致隐球菌性脑膜炎/脑膜脑炎 (cryptococcal meningitis/meningoencephalitis，CME)，是隐球菌病高病死率的最重要的原因。血脑屏障可以抑制循环血中大部分分子入脑，而转运蛋白可以参与其新陈代谢[7]。因此，在前期研究基础上，我们分别构建沉默表达MMP9、S100A10的b.End3稳转细胞系，为进一步探索隐球菌的嗜中枢神经性提供基础，为临床防治提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

慢病毒构建相关材料由上海吉凯生物有限公司提供；小鼠脑微血管内皮细胞bEnd3购自ATCC；细胞培养所需胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；荧光显微镜为MODEL IX70-S8F2；嘌呤霉素购自上海吉凯生物有限公司。

1.2 方法

MMP9、S100A10引物设计 GenBank上查找小鼠MMP9、S100A10 cDNA序列，分别是：NM_013599.4、NM_009112.2。CDs区分别为：39-2231、116-409。利用AlleleID 6.0软件设计基因引物序列，MMP9引物序列为：Forward Primer 5’-CTGGACAGCCAGACACTAAAG-3’,Reverse Primer 5’-CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG-3’；S100A10引物序列为：Forward Primer 5’-AGGACCTGAGAGTGCTCATGGAAC-3,Reverse Primer 5’-CTGGAAGCCCACTTTGCCATCTC-3’。利用BLAST比对，由上海生工生物公司合成。

慢病毒构建 慢病毒载体中anti-MMP9-siRNA序列，CTACGATAAGGACGGCAAA。Anti-s100a10-siRNA序列：GGCTTCCAGAGCTTTCTAT。载体购自上海吉凯生物有限公司。

小鼠脑微血管内皮细胞b.End3 培养 用含10%胎牛血清 (GIBCO)的DMEN (GIBCO)完全培养液，将细胞b.End3培养于37℃、5%CO2培养箱中。

确定慢病毒转染细胞的MOI和最佳感染条件 将细胞悬液调至4×104/mL，100 μL/孔加入96板，按不同施加条件分5组，包括：空白组 (培养基100 μL)、A (培养基90 μL+virus 10 μL)、B (培养基80 μL+polybrene 10 μL+virus 10 μL)、C (ENi.S 90 μL+virus 10 μL)、D (ENi.S 80 μL+polybrene 10 μL+virus 10 μL)，24 h后细胞汇合率30%时，即可加入慢病毒，将慢病毒稀释成5个浓度梯度，分别为：1×108TU/mL、5×107TU/mL、2×107TU/mL、1×106TU/mL，分别对应MOI值为100、50、20、1。12 h后换回常规培养基，72 h后荧光显微镜观察。

确定嘌呤霉素筛选稳定株的浓度 将b.End3 在24孔板以6×104/孔的密度铺板。孵育过夜后换液，将配制成0～10 μg/mL (1 μg/mL为区间)11个梯度的含嘌呤霉素的培养基分别加入对应孔中，每2天更换新鲜的筛选培养基，监测细胞成活比例。

LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA分别转染b.End3 将细胞悬液调至4×104/mL，500 μL/孔加入24孔板，24 h后将空载慢病毒 (NC)、LV-musMMP9-shRNA、LV-musS100A10-shRNA调成MOI为20的病毒液所需体积[体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度]，按照事先确定的转染条件换液。培养12 h后更换为常规培养基。

筛选稳定株 病毒转染后待细胞约长至80%～90%，用嘌呤霉素筛选培养基孵育，筛选4次，之后用含0.1 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持。

RT-qPCR分别检测稳转细胞系MMP9、S100A10的基因表达 将筛选4次后的细胞铺板，将6孔板铺满90%，抽提RNA，逆转录为cDNA后，用TopGreen qPCR Super Mix行qPCR检测。

2 结 果

2.1 荧光显微镜确定转染条件

细胞生长良好，感染效率在80%左右所对应的感染条件为：ENi.S 90 μL+virus 10 μL，MOI为20，慢病毒浓度为2×107TU/mL (见图1)。

2.2 制备筛选培养基

24孔板的b.End3在含1 μg/mL嘌呤霉素的培养基培养条件下，可在第4天杀灭所有细胞，故将此浓度定为筛选培养基的药物浓度。

2.3 表达载体测序结果

LV-musMMP9-shRNA：ccgggaCTACGATA

AGGACGGCAAActcgagTTTGCCGTCCTTATC

GTAGtctttttg

LV-musS100A10-shRNA：ccggGGCTTCCA

GAGCTTTCTATctcgagATAGAAAGCTCTGGA

AGCCtttttg

上述结果与将各自靶序列设计相应的短发夹RNA (shRNA)，根据载体多克隆位点引入Age I和EcoR I酶切位点的序列一致。

2.4 b.End3细胞形态观察

b.End3细胞购自ATCC，在含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中生长状态良好，为下一步实验奠定基础 (见图2)。

2.5 荧光显微镜检测稳转细胞慢病毒转染效率

本实验所用慢病毒载体携带绿色荧光蛋白序列，明暗场在同一视野下，产生绿色荧光说明该细胞已被成功转染目的序列，且绿色荧光蛋白表达越多，转染率越高 (见图3～5)。

2.6RT-qPCR分别检测MMP9、S100A10基因表达

沉默MMP9的b.End3，MMP9的敲减效率达78.8% (见图6)，经S-N-K检验，认为慢病毒沉默MMP9的b.End3细胞与NC组、b.End3组差别有统计学意义，P<0.05，而b.End3组与NC组的MMP9表达的差异无统计学意义。沉默S100A10的b.End3，S100A10的敲减效率达76.0% (见图7)，经S-N-K检验，认为慢病毒沉默S100A10的b.End3细胞与NC组、b.End3组差别有统计学意义，P<0.05，而b.End3组与NC组的MMP9表达的差异无统计学意义。

图1 小鼠脑微血管内皮细胞b.End3转染条件下的明视野和暗视野观察结果 (ENi.S 90 μL+virus 10 μL，其中慢病毒浓度为2×107TU/mL) 图2 显微镜下小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3的体外培养结果 (a.10×，b.40×) 图3 LV-musMMP9-shRNA b.End3的暗视野和明视野 图4 LV-musS100A10-shRNA b.End3的暗视野和明视野 图5 LV-NC-shRNA b.End3的暗视野和明视野 图6 b.End3、NC、LV-musMMP9-shRNA b.End3 3种细胞MMP9表达量比较 图7 b.End3、NC、LV-musS100A10-shRNA b.End3 3种细胞MMP9表达量比较

Fig.1 Observation of b.End3 from Bright field & Dark field after transfection (ENi.S 90 μL+virus 10 μL，concentration of lentivirus is 2×107TU/mL) Fig.2 The observation of b.End3 (a.10×,b.40×) Fig.3 The observation of Bright field & Dark field of LV-musMMP9-shRNA b.End3 Fig.4 The observation of Bright field & Dark field of LV-musS100A10-shRNA b.End3 Fig.5 The observation of Bright field & Dark field of LV-NC-shRNA b.End3 Fig.6 The expression quantity of MMP9 from b.End3,NC and LV-musMMP9-shRNA b.End3 Fig.7 The expression quantity of S100A10 from b.End3,NC and LV-musS100A10-shRNA b.End3

3 讨 论

目前，隐球菌性脑膜炎在免疫未见异常的人群中发病率逐年增高，隐球菌强烈的嗜中枢神经性是探索该疾病病理生理机制的突破口，而其通过血脑屏障的机制是关键。

血脑屏障可以抑制循环血中大部分分子入脑，而转运蛋白可以参与其新陈代谢[7]。若隐球菌能作用于转运蛋白或者其转导通路，就能穿透血脑屏障并且侵袭中枢神经系统[8]。

S100A10蛋白，是一种纤溶酶原调节蛋白，是钙结合蛋白家族中的S100蛋白家族中的一员，可与膜联蛋白A2 (annexin A2)结合形成异四聚体 (S100A10)2-(annexinA2)2，作为膜蛋白存在于多种细胞的细胞膜上，与细胞的胞吞胞吐、物质转运等密切相关。异四聚体 (S100A10)2-(annexinA2)2可使纤溶酶原被tPA (组织型纤溶酶原激活剂)、uPA (尿激酶型纤溶酶原激活剂)激活为纤溶酶，其可降解细胞基质，间接激活MMP9 (基质金属蛋白酶9)，促使病原穿过基底膜[9]。肿瘤细胞、巨噬细胞、细菌和真菌因该纤溶酶原系统增强其侵袭或迁移能力。Zhang等[10]发现，小鼠在创伤应激后，前额叶的S100A10蛋白表达增加；Rand等[11]发现在脑室管膜肿瘤复发病例中，S100A10表达水平上升非常明显。我们前期实验证明[12]，新生隐球菌B3501与b.End3共孵育后，S100A10蛋白表达增加。

既往研究显示，S100A10下调的巨噬细胞纤溶酶表达减少，pro-MMP9活化减少[13]。MMP-9蛋白，是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶MMPs中的一员，体内绝大多数细胞不储备MMPs，在需要MMPs信号传递到细胞后临时合成，并以无活性的酶原形式分泌到胞外[14]，主要分解Ⅳ型基质蛋白，MMPs与血脑屏障开放[15]有关。Tang等[16]研究发现，用慢病毒下调小鼠B16细胞MMP9蛋白表达，其黑素瘤侵袭能力明显下降。血脑屏障基底膜主要成分为Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白和微纤维蛋白，MMP9可降解微血管内皮细胞的紧密连接蛋白occludin、基底膜Ⅳ型基质蛋白，也同时能被紧密连接蛋白claudins激活[17]，促进病原体从脉管系统向周缘组织侵袭[18]。故本实验探索下调b.End3 的S100A10表达是否可引起MMP9表达或功能改变，可进一步查看MMP9是否在隐球菌跨越血脑屏障过程中发挥相应的作用。

本实验选择慢病毒作为载体转染宿主细胞，是真菌致病机制研究方面的创新，构建有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系，以单一变量为控制，直观探究S100A10、MMP-9影响隐球菌穿过血脑屏障的能力。慢病毒是一种以人类免疫缺陷I型病毒 (HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。De Ravin等[19]曾用慢病毒造血干细胞移植基因成功治疗5例SCID-X1连锁的免疫功能紊乱。与腺病毒或逆转录病毒相比，慢病毒有以下优点：其能够将病毒承载的基因整合到宿主基因组后长时间稳定表达，具有低免疫原性，制作动物模型的基因下调可达50%以上，可用四环素类药物诱导；此外，下调目的基因表达同时，不产生额外有效的免疫应答，不产生可见的病理学现象，可保证本课题组实验的单一变量原则。同时，构建所得细胞能稳定传代，方便实验重复，故本实验选择慢病毒作为载体构建稳转细胞系是方便、可行、可信的。

本实验中，将稳转细胞系铺板孵育过夜，荧光显微镜下可见两种慢病毒转染细胞的绿色荧光表达可达100%，RT-qPCR检测显示，NC组MMP9与S100A10表达有所下调，但与正常细胞组比较，这两者表达均无统计学差异 (P>0.05)，说明b.End3转染空载病毒对细胞本身的影响的差异没有统计学意义，故可以使用NC b.End3作为空白对照。而转染组与空载慢病毒NC组比较，差异有统计学意义 (P<0.01)，下调率分别为78.8%、76.0%。可见慢病毒转染的b.End3可稳定沉默目的基因表达，细胞系筛选成功，为进一步探究b.End3细胞沉默S100A10、MMP-9表达后如何影响隐球菌通过体外血脑屏障的能力等研究奠定了基础。

关于隐球菌性脑膜炎的基础研究，研究者关注点多集中于菌种探究，而本研究立足于疾病本身并着眼于宿主，根据基因芯片的前期相关结果，分别利用慢病毒构建能有效干扰S100A10、MMP-9表达的稳转细胞系，以其控制单一变量应用于隐球菌性脑炎/脑膜炎的研究，在方法学上是一种创新，从结果看，它能直观判断感染源与宿主作用后目的蛋白的改变，有利于将结果更快更好地预测临床。

[1] Park BJ,Wannemuehler KA,Marston BJ,et al.Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS[J].AIDS,2009,23(4):525-530.

[2] Casadevall A,Perfect JR.Cryptococcusneoformans[M].1st edition.American Society for Microbiology,Washington,DC:ASM Press,1998.

[3] Subramanian S,Mathai D.Clinical manifestations and management of cryptococcal infection[J].J Postgrad Med,2005,51(Suppl 1):S21-S26.

[4] Lambertucci JR,Franco R,de Queiroz LC.Cryptococcal meningoencephalitis and pulmonary nodule in a non-HIV-infected immunocompetent patient[J].Rev Soc Bras Med Trop,2005,38(2):207-208.

[5] Drouet A,Amah Y,Pavic M,et al.Subacute meningoradiculomyeloencephalitis due to cryptococcosis infection[J].Rev Med Interne,2005,26(5):403-408.

[6] Pukkila-Worley R,Mylonakis E.Epidemiology and management of cryptococcal meningitis:developments and challenges[J].Expert Opin Pharmacother,2008,9(4):551-560.

[7] Barros LF,Bittner CX,Loaiza A,et al.A quantitative overview of glucose dynamics in the gliovascular unit[J].Glia,2007,55(12):1222-1237.

[8] Tseng HK,Huang TY,Wu AY,et al.HowCryptococcusinteracts with the blood-brain barrier[J].Future Microbiol,2015,10(10):1669-1682.

[9] O'Connell PA,Surette AP,Liwski RS,et al.S100A10 regulates plasminogen-dependent macrophage invasion[J].Blood,2010,116(7):1136-1146.

[10] Zhang L,Li H,Su TP,et al.p11 is up-regulated in the forebrain of stressed rats by glucocorticoid acting via two specific glucocorticoid response elements in the p11 promoter[J].Neuroscience,2008,153(4):1126-1134.

[11] Rand V,Prebble E,Ridley L,et al.Investigation of chromosome 1q reveals differential expression of members of the S100 family in clinical subgroups of intracranial paediatric ependymoma[J].Br J Cancer,2008,99(7):1136-1143.

[12] 李平.甘露糖受体MR参与隐球菌免疫逃逸及S100A10促进隐球菌穿过血脑屏障的机制研究[D].第二军医大学,2013.

[13] O'Connell PA,Surette AP,Liwski RS,et al.S100A10 regulates plasminogen-dependent macrophage invasion[J].Blood,2010,116(7):1136-1146.

[14] Vandooren J,Van den Steen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9):the next decade[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(3):222-272.

[15] Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain:activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures[J].Brain Res,2001,893(1-2):104-112.

[16] Tang ZY,Liu Y,Liu LX,et al.RNAi-mediated MMP-9 silencing inhibits mouse melanoma cell invasion and migrationinvitroandinvivo[J].Cell Biol Int,2013,37(8):849-854.

[17] Lohmann C,Krischke M,Wegener J,et al.Tyrosine phosphatase inhibition induces loss of blood-brain barrier integrity by matrix metalloproteinase-dependent and-independent pathways[J].Brain Res,2004,995(2):184-196.

[18] Stie J,Bruni G,Fox D.Surface-associated plasminogen binding ofCryptococcusneoformanspromotes extracellular matrix invasion[J].PLoS ONE,2009,4(6):e5780.

[19] De Ravin SS,Wu X,Moir S,et al.Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency[J].Sci Transl Med,2016,8(335):335ra57.

[本文编辑] 卫凤莲

Construction and verification of stable down-regulated MMP9,S100A10 mouse brain microvascular endothelial cell lines

CHEN Xue-wen,ZHU Hong-mei,WEN Hai

(PLAKeyLaboratoryofFungalDiseasesandShanghaiKeyLaboratoryofMolecularMedicalMycology,DepartmentofDermatology,ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China)

Objective To construct stable down-regulated MMP9,S100A10 mouse brain microvascular endothelial cell lines,then verify the reduction level of gene expression.Methods By transfecting LV-musMMP9-shRNA,LV-musS100A10-shRNA into b.End3 respectively,then the very cell lines were screened by puromycin.The obtained differential b.End3 cell lines were observed by fluorescence microscope and varified by RT-qPCR.Results The study successfully constructed stable transfected cell lines which could effectively interference S100A10,MMP-9 expression of 3×108TU/mL and 1×108TU/mL LV-musS100A10-shRNA respectively.Conclusions The targeted down-regulation b.End3 cell lines are useful for further exploring the role of molecule S100A10 or MMP-9 in host blood-brain barrier by control variables and the possible target of treatment exploration of cryptococcal encephalitis/meningitis.

Lentivirus vector；MMP9；S100A10；b.End3

19-22]

国家自然科学基金 (31470252，81271800，31270181)

陈雪雯，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:snowflychen@163.com

温海,E-mail:wenhaipfk@126.com;朱红梅,E-mail:hmzhu_cn@163.com90%

R 392.1

A

1673-3827(2017)12-0019-04

2016-10-16