茅台地区酱香型酒糟中高温真菌的分离鉴定

任勰珂，陈莉,3*，卢红梅,3，周莲，贾青慧，白成松

茅台地区酱香型酒糟中高温真菌的分离鉴定

任勰珂1，陈莉1,3*，卢红梅1,3，周莲2，贾青慧2，白成松1

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025；3.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025）

从茅台地区酱香型酒糟中分离筛选出4株耐高温真菌M1、M4、M5以及M6。对各菌株的降解特性研究表明：菌株M4有一定的淀粉和蛋白质分解能力；菌株M5纤维素分解能力较强，55℃时其Hc值能达到3.21，有一定的淀粉分解能力；菌株M1、M6有一定的淀粉、纤维素和蛋白质分解能力。通过筛选菌株的细胞形态、菌落形态、ITS序列分析以及系统发育分析，鉴定菌株M1是微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、菌株M4是嗜热篮状菌（Talaromyces thermophilus）、菌株M5是黑曲霉（Aspergillus niger）、菌株M6是肿梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

酱香型酒糟；高温真菌；分离鉴定；ITS序列分析

酒糟别名红糟、粕等，是米、麦、高梁等酿酒后剩余的残渣。我国酒糟的综合利用能力较低，主要应用于生产饲料、有机肥等[1]。贵州省作为酱香型白酒主产区之一，每年产生近百万吨的白酒酒糟，废弃酒糟量巨大且极易发生霉变，若不及时处理就会造成资源浪费、环境污染。如何高效、经济、环保地综合利用酒糟逐渐成为人们所关注的焦点。目前，白酒生产过程中酒糟资源化利用的问题成为我国白酒产业快速发展所面临的主要障碍[2]。高温菌是一类能在45℃以上生长和繁殖的嗜热微生物，降解性能好、代谢效率高，在很多领域都发挥着重要的作用[3]。若将菌株引入到酒糟中，可生产动物饲料及生物有机肥。这既能很好地解决对环境的污染问题，又带来了一定的经济效益，由此可见，发展酒糟的综合利用值得大力推广[4-5]。本实验从茅台地区酱香型白酒酒糟中筛选出耐高温真菌，通过对其进行相关特性研究，以期为后续高温菌剂的制备及生物有机肥的生产奠定基础，这对于加强酒糟的资源化利用，促进白酒产业的持续发展都将具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

酒糟：取自茅台镇第七轮次抛糟的酱香型白酒酒糟。

1.1.2 试剂

无水乙醇（分析纯）、体积分数为95%乙醇：大津市富宇精细化工有限公司；可溶性淀粉（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；番红O（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；高蛋白脱脂高钙奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；刚果红：天津市科密欧化学试剂有限公司；卢戈氏碘液：I 1 g，KI 2 g，去离子水300 mL，先用少量去离子水溶解KI，再将I加入其中溶解完全，最后补水至300 mL。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）：马铃薯浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH 5.8～6.2，121℃灭菌20 min。

纤维素培养基：羧甲基纤维素钠2 g，（NH4）2SO41 g，KH2PO41 g，酵母膏1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，CaCl20.25 g，去离子水1 000 mL，pH自然，115℃灭菌30 min。

淀粉培养基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH自然，120℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

DMS-653生物数码显微镜：深圳市博宇仪器有限公司；SPX-250B智能型生化培养箱、DHG-9140B（101-2B）智能型电热恒温鼓风干燥箱：上海琅歼实验设备有限公司；YXQ-LS-5DS11立式压力蒸汽灭菌器、SN-CJ-IF洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FlexCycler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Analytik Jena公司；BIORAD水平电泳系统：美国Bio-rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒糟中高温真菌的分离筛选及形态观察

将酒糟制成不同稀释梯度的菌液均匀涂布在PDA培养基上，55℃倒置培养24 h。仔细观察菌落特征及个体形态，将不同特征、生长良好的单个菌落用无菌接种针挑出，在PDA培养基上划线培养，经过7～8次得到纯种高温菌。

形态观察：将分离纯化的菌株划线接种在相应的培养基上，55℃培养12～72 h[6]，观察菌落特征；将筛选出的菌株分离纯化后采用透明胶带法，于光学显微镜下观察个体形态。

1.3.2 酒糟中高温真菌的生长特性研究

最适生长温度的测定：将霉菌在PDA平板上活化，挑取长势相同的小菌落接种在PDA平板上，分别置于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的恒温生化培养箱中培养3 d，每个温度条件下培养3组，用十字交叉法测定菌落大小，取平均值，并绘制各菌株的生长温度测量曲线。

生长曲线的绘制：将霉菌接种到PDA试管斜面上，在50℃，湿度90%的恒温恒湿箱中培养3 d，待孢子丰富后，用移液器向试管中加入10 mL的无菌生理盐水，充分摇匀后，吸取0.1 mL的孢子悬液接种到装有100 mL改良马丁培养基的250 mL三角瓶中，每种菌株做3组，50℃、120 r/min条件下摇床培养，每隔1 d将三角瓶取出置于冰箱中保存，共测5 d，待全部培养结束后，依次将培养液用真空泵抽滤于定量滤纸上，在100℃条件下烘箱烘至质量恒定后，电子天平称量与之前定量滤纸的质量差为菌体干质量，求出平均值，绘制霉菌的生长曲线图。

1.3.3 酒糟中高温真菌的降解特性研究

菌株的淀粉降解特性试验：（1）配制淀粉培养基，待平板凝固后放在55℃培养箱中过夜；（2）在平板上接种待测菌株后，分别在50℃和55℃的条件下培养3 d，每个温度条件设置3个平板，培养结束后在平板上滴加卢戈氏碘液，观察记录透明圈大小，根据透明圈的大小和其菌落直径的比值（Hc值）判断微生物分解淀粉能力的强弱[7]。

菌株的纤维素降解特性试验：（1）配制纤维素降解培养基，倒平板，待凝固后放在55℃培养箱中过夜；（2）在平板上接种待测菌株后，分别在50℃和55℃的条件下培养3d，每个温度条件设置3个平板，待培养时间结束后，将1 g/L的刚果红溶液倒入平板中没过培养基，浸泡30 min，再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡30 min，观察记录透明圈大小，计算Hc值取平均值[8]。

菌株的蛋白质降解特性试验：（1）每升琼脂培养基中加入10 g脱脂奶粉，配制蛋白降解培养基。脱脂奶粉真空包装袋紫外杀菌1 h，与灭菌的琼脂培养基混合均匀后倒平板，待凝固后放于各菌株最适培养温度的培养箱中过夜；（2）在平板上穿刺接种待测菌株后，分别在50℃和55℃的条件下培养，每个温度条件设置3个平板，每隔一段时间观察一次平板的透明区域，待培养结束后，观察记录各平板的总透明范围，如果微生物菌株能产胞外蛋白酶，则可将脱脂奶粉中的蛋白水解，使菌落周围的乳黄色褪去[9]。出现透明表示菌株能利用蛋白，为阳性反应（用“+”表示），未出现透明表示菌株不能利用蛋白，为阴性反应（用“-”表示）[10]。

1.3.4 酒糟中高温真菌的鉴定

霉菌基因组DNA的提取：取少量菌丝用液氮充分研磨后均分置两个离心管中，加入1 mL抽提缓冲液涡旋混匀。每管加60μL20%的十二烷基磺酸钠，65℃温育30min（10min颠倒一次），再加入150μL5mol/LNaCl、130μL十六烷基三甲基溴化铵/NaCl溶液，颠倒混匀，65℃温育30min（10 min颠倒一次）。将每管分成2管，加等体积的苯酚、氯仿、异戊醇轻轻颠倒混匀10000r/min，4℃离心10min。取上清液加等体积的氯仿，轻轻颠倒混匀后10 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液加1/10体积的3 mol/L NaAC，等体积的异丙醇（预冷）-20℃放置1～2 h，10 000 r/min，4℃离心10min，弃异丙醇，加体积分数为70%乙醇500μL洗两次，每次洗后都要4℃离心10min，然后室温干燥。加100μLTE，置于4℃溶解，加8μL核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）A 4℃过夜。加等体积的氯仿颠倒混匀后，4℃、10 000 r/min离心，取上清液-20℃保存。

rDNA ITS区段的PCR扩增及测序：以提取的DNA为模板，通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。所有PCR均在25 μL标准反应体系中进行，反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃复性40 s，72℃延伸1 min，10个循环；最后于72℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳，150 V、100 mA、20 min对PCR扩增产物进行检测[12]。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用小量胶回收试剂盒从含有扩增产物条带的琼脂糖凝胶上进行回收、纯化，具体操作见试剂盒。纯化的后送上海生工公司进行测序，测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱进行人工校正[13]。

系统发育树的构建：用BLAST将测序结果在NCBI中与已知霉菌的rDNA ITS区段基因序列进行同源性分析，并用MEGA5.10软的Neighbor-Joining法构建系统发育树，具体确定菌株的种属[14]。

2 结果与分析

2.1 酒糟中高温真菌的分离及形态观察

通过实验分离出四株高温菌，分别编号为M1、M4、M5、M6，其菌落形态见图1。

图1 部分菌株的菌落形态Fig.1 Colonial morphology of part strains

菌落观察得知，4株菌菌落干燥，M1呈疏松绒毛状、初期白色后期灰色；M4为疏松棉絮状、初期白色后期呈浅粉红色；M5呈松散绒毛状、初期白色后期呈青绿色；M6呈疏松绒毛状、初期白色后期灰色。初步观察后进行显微镜镜检，结果见图2。

图2 部分菌株镜检结果（10×40）Fig.2 Microscopy results of part strains(10×40)

由图2可知，菌株M1菌丝无隔，无假根，有典型孢子囊，孢子量大；菌株M4菌丝有隔，具有扫把状的分生孢子头；菌株M5菌丝无隔，无假根，有典型孢子囊，孢子量大；菌株M6菌丝无隔，无假根，有典型孢子囊，孢子量大。根据各菌株培养的不同菌落形态特征和镜检图，配合实验查找手册[15]，初步判断菌株M1为一株毛霉；M4为一株青霉；M5为一株曲霉；M6为一株毛霉。

2.2 酒糟中高温真菌的生长特性研究

2.2.1 最适生长温度

四株菌的生长温度曲线见图3。由图3可知，菌株M1的最适生长温度为45℃，M4的最适生长温度为50℃，M1、M4在40～55℃均能较好的生长；M5的最适生长温度为40℃，在35～45℃均能较好的生长；M6的最适生长温度为40℃，在35～50℃均能较好的生长。因此，可以利用温度对菌株生产快慢的影响来控制菌落大小、测定不同长势条件下的有机质分解能力。

2.2.2 生长曲线

图4 菌株M1(A)、M4(B)、M5(C)和M6(D)的生长曲线Fig.4 Growth curve of strains M1(A)、M4(B)、M5(C)and M6(D)

四株菌的生长曲线见图4。由图4可知，四种菌株在培养1 d后均有大量菌体生成，1～3 d菌体干质量快速上升，第3天达到最大值后开始下降，上升和下降趋势均较缓和。由菌体干质量的变化趋势可知，菌株M1、M4、M5、M6发酵周期均为3 d。

2.3 酒糟中高温真菌的降解特性研究

2.3.1 菌株的淀粉降解特性试验

菌株的淀粉降解实验结果见表2。由表2可知，每株菌都能产生胞外淀粉酶，对比50℃和55℃条件下的淀粉降解能力可知，在55℃条件下，淀粉降解能力有所提高，尤其以菌株M1、M6的淀粉降解能力提高最为明显。从这一实验现象可知，升温可以提高菌株的淀粉降解能力，通过调节培养温度可以实现菌株的快速生长和高降解效果的转变。

表2 菌株的淀粉降解实验结果统计Table 2 Experimental results of starch degradation of strains

2.3.2 菌株的纤维素降解特性实验

菌株的纤维素降解实验结果见表3。由表3可知，仅菌株M4不能产生纤维素分解酶，在55℃培养条件下，菌株M5的生长速度极为缓慢，3 d只能长出很小的菌落。其余菌株虽然纤维素分解能力都较弱，但在纤维素培养基上能较好生长。对比50℃和55℃条件下的纤维素降解能力可知，在55℃条件下纤维素降解能力有所提高。

表3 菌株的纤维素降解实验结果统计表Table 3 Experimental results of cellulose degradation of strains

2.3.3 菌株的蛋白质降解特性实验

每隔一段时间对蛋白质降解培养基平板透明区域产生情况进行观察并记录，3 d后作出汇总得到表4。由表4可知，仅菌株M5不能产生胞外蛋白酶，菌株M4的蛋白质分解能力较高，菌株M1、M6则较弱。

表4 菌株的蛋白质降解特性实验结果统计表Table 4 Experimental results of protein degradation characteristics of strains

2.3.4 rDNA ITS序列分析及基因系统发育分析

用1%琼脂糖凝胶电泳检测ITS区扩增产物，结果见图5。

图5 菌株M1、M4、M5和M6的PCR扩增电泳图Fig.5 Electrophoretogram of PCR amplification strains M1,M4,M5 and M6

由图5可知，发现在500～600 bp处有一明亮条带，测序结果表明，菌株M1、M4、M5、M6的基因序列长度依次为534 bp、544 bp、557 bp和517 bp，与检测结果相符合。

将菌株M1、M4、M5、M6的ITS序列测序结果与NCBI中已报道的模式菌株序列进行比对可知，菌株M1、M6与根毛霉属（Rhizomucor）成员有较高的序列同源性，在86%～99%之间，其中菌株M1、M6与牛根毛霉（Rhizomucor tauricus）和微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）的同源性达到99%，说明菌株M1、M6与这两个种具有最高的序列同源性；菌株M4与踝节菌属（Talaromyces）和嗜热真菌属（Thermomyces）成员有较高的序列同源性，在88%～99%之间，其中菌株M4与嗜热蓝状菌（Talaromyces thermophilus）的同源性到达99%；菌株M5与青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、芬尼菌属（Fennellia）成员有较高的序列同源性，在96%～99%之间，其中菌株M5与青霉菌（Penicillium malachiteum）、曲霉属（Aspergillus cervinus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黄柄芬尼菌（Fennellia flavipes）的同源性到达99%。

用MEGA5.10构建的系统发育树如图6所示，通过与进化关系比较亲近的属种进行系统发育学分析可知，M1、M6均属于毛霉属，M1与毛霉属中的根毛霉（Rhizomucor pusillus）和丝瓜毛霉（Rhizomucor tauricus）亲缘关系最近，三者在同一进化分支上；M6与毛霉属中的丝瓜毛霉（Rhizomucor tauricus）亲缘关系最近，两者在同一进化分支上；M4属于青霉属，M4与青霉属中的亚属踝节菌属中的嗜热蓝状菌（Talaromyces thermophilus）亲缘关系最近，两者在同一进化分支上；M5属于曲霉属，M5与曲霉属中的黑曲霉（Aspergillus niger）亲缘关系最近，两者在同一进化分支上。结合菌株M1、M4、M5、M6的细胞形态、菌落形态、ITS序列分析以及系统发育分析可以鉴定：菌株M1是微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、菌株M4是嗜热蓝状菌（Talar-omycesthermophilus）、菌株M5是黑曲霉（Aspergillusniger）、M6是肿梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

图6 菌株M1(A)、M4(B)、M5(C)和M6(D)的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain M1(A),M4(B),M5(C)and M6(D)

3 结论

从茅台菌株地区酱香型酒糟中分离筛选出4株耐高温菌株M1、M4、M5、M6，它们的最适生长温度依次为45℃、50℃、55℃、40℃，从降解实验现象可知，4株菌均可以通过调节培养温度来实现菌株的快速生长和高降解效果的转变。其中菌株M1有一定的淀粉、纤维素和蛋白质分解能力，菌株M4有一定的淀粉和蛋白质分解能力，菌株M5纤维素分解能力较强，其55℃时Hc值能达到3.21，有一定的淀粉分解能力，菌株M6有一定的淀粉、纤维素和蛋白质分解能力。结合四种菌株的细胞形态、菌落形态、生理生化特征、ITS序列分析以及系统发育分析可以初步鉴定菌株M1、M4、M5、M6依次为微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、嗜热蓝状菌（Talaromyces thermophilus）、黑曲霉（Aspergillusniger）、肿梗根毛霉（Rhizomucor tauricus）。

这4种菌株能够降解淀粉、纤维素和蛋白质，在酒糟中繁殖旺盛，菌株的生产速度和降解效果可依据需要人工调节。若将实验高温菌株引入到酒糟中，利用高温菌产生的耐热酶加快酒糟成分的降解，可明显缩短堆肥周期，把酒糟发酵为生物有机肥，有效解决农作物肥料供应问题和酒糟资源化利用的问题。有利于可持续发展和白酒产业体系的构建，对扩大酒糟资源和高温菌的综合利用范围具有积极意义。

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Isolation and identification of thermophilic fungi from Moutai-flavor vinasse in Moutai area

REN Xieke1,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,ZHOU Lian2,JIA Qinghui2,BAI Chengsong1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 5500025,China;2.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guiyang 5500025,China)

The thermophilic fungi strains M1,M4,M5 and M6 were isolated and screened from Moutai-flavor vinasse in Moutai region.The degradation characteristics of each strain were studied,and the result showed that strain M4 had a certain ability to decompose starch and protein; strain M5 had a strong ability to decompose cellulose,which had a certain amylolytic ability and the Hc value could reach 3.21 when the temperature was 55℃;strains M1 and M6 both had a certain ability of decomposing starch,cellulose and protein.By cell morphology,colony morphology,ITS sequence analysis and phylogenetic tree analysis,the strains M1,M4,M5,M6 could be identified asRhizomucor pusillus,Talaromyces thermophilus, Aspergillus niger,Rhizomucor tauricus,respectively.

Moutai-flavor vinasse;thermophilic fungi;isolation and identification;ITS sequence analysis

TS261.9

0254-5071（2017）02-0069-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.015

2016-09-29

贵州省科技合作计划项目（黔科合LH字[2016]7453号）

任勰珂（1992-），女，硕士研究生，研究方向为微生物。

*通讯作者：陈莉（1981-），女，副教授，硕士，研究方向为微生物。