人非小细胞肺癌组织中miR-200b的表达变化及意义

罗卫民，罗湘玉，郭家龙，林称意，张军

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

人非小细胞肺癌组织中miR-200b的表达变化及意义

罗卫民，罗湘玉，郭家龙，林称意，张军

(湖北医药学院附属十堰市太和医院，湖北十堰442000)

目的 观察微小RNA-200b(miR-200b)在人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达变化，并探讨其临床意义。方法 采用原位杂交技术检测88例NSCLC组织与癌旁正常肺组织中的miR-200b表达，分析miR-200b与NSCLC患者临床病理参数及预后的关系。结果 NSCLC组织中miR-200b阳性表达率低于癌旁正常组织(P<0.05)。miR-200b表达与NSCLC患者的TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。随访截止2016年2月10日，miR-200b低表达NSCLC患者病死率高于高表达者，中位生存时间短于高表达者(P均<0.05)。结论 miR-200b在NSCLC组织中呈低表达，其可作为评估患者临床分期、淋巴结转移及预后的生物学指标之一。

非小细胞肺癌；微小RNA-200b；预后

非小细胞肺癌(NSCLC)发病率约占肺癌的80%[1]。肺癌病死率高，在初次诊断后5年生存率低于15%，转移是患者死亡的主要原因[2]。肺癌的发生涉及多因素、多分子[3]。研究NSCLC发生的分子机制，有助于NSCLC早期检测标志物和治疗方法的确定。微小RNA(miRNA)是一类非编码小RNA分子，通过与靶mRNA3′非翻译区结合，在转录后和(或)转录水平调控基因的表达，在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色[4]。研究显示，miR-200b在胃癌、胶质瘤、乳腺癌等肿瘤组织中表达下调，并具有类似抑癌基因样作用[5]；且有研究认为，miR-200b可作为肺癌早期诊断的生物标志物[6]。本研究观察miR-200b在人非小细胞肺癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年9月～2014年8月本院收治的NSCLC患者88例，均经病理检查确诊。其中男49例、女37例，年龄35～74岁；术前均未行放化疗。术后留取肿瘤组织；另取48例癌旁正常组织(距肿瘤组织>5 cm)作对照。出院后对患者进行电话随访，最长随访时间为64个月，随访截止2016年2月10日。

1.2 癌组织与癌旁正常组织中miR-200b表达检测 采用原位杂交法。肺组织芯片脱蜡至水；3%胃蛋白酶消化15～20 min，水洗后4%甲醛固定；按miRNA探针说明书进行操作，探针用无酶水稀释，稀释终比例为1∶600，先用预杂交液于55 ℃预杂交2 h后再用地高辛标记的miR-200b探针(购自美国Exiqon公司)于55 ℃进行杂交过夜；次日用不同浓度SSC缓冲液依次洗涤；室温封闭30 min；生物素化鼠抗地高辛室温孵育2 h；镜下进行DAB显色并控制显色时间；苏木素复染细胞核，充分水洗，中性树胶封片保存。结果判定：镜下观察呈棕黄色颗粒的阳性信号定位于细胞质与胞核中为miR-200b表达阳性。对miR-200b信号强度进行评分，无信号≤1分，弱阳性信号>1～2分，中等阳性信号>2～3分，强阳性信号>3～4分。在400倍显微镜下每个标本选取3个视野，统计miR-200b阳性细胞所占百分比。信号强度得分×阳性细胞百分比<2为miR-200b低表达，≥2为miR-200b高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 生存曲线分析患者预后。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织与癌旁正常组织中miR-200b表达比较 NSCLC组织中miR-200b阳性表达32例，阳性表达率为36.36%；癌旁正常组织中miR-200b阳性表达30例，阳性表达率为62.50%；二者阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miR-200b表达与NSCLC患者临床病理参数的关系 miR-200b表达与NSCLC患者的TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。而不同年龄、性别、组织学类型及吸烟患者间miR-200b表达差异无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

2.3 miR-200b表达与NSCLC患者预后的关系 随访至2016年2月10日，NSCLC组织中miR-200b低表达56例，死亡34例，病死率60.71%；miR-200b高表达32例，死亡11例，病死率34.38%；二者病死率比较差异有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析发现，miR-200b低表达者中位生存时间为(23.51±6.24)个月，miR-200b高表达者中位生存时间为(40.26±11.07)个月；二者中位生存时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 miR-200b表达与NSCLC患者临床病理参数的关系(例)

3 讨论

生物信息学和微阵列芯片研究显示，miRNAs可直接调控人类1/3至半数的基因，且每个miRNA预测可靶向调控几百个转录本，表明miRNAs可能是人类最大的基因调控者[7]。miRNAs参与调控多种生物学过程，如细胞分化、增殖、血管生成、新陈代谢以及肿瘤的发生发展。越来越多的研究者对miRNAs在细胞系、组织以及血清样本中进行表达谱分析，以鉴定新的肿瘤标志物，如血清miRNA-24、miRNA-320a、miRNA-423-5p可用于结肠癌的早期诊断[8]。miR-21与miR-210在乳腺癌中高表达，与患者的不良预后相关[9]。在骨肉瘤中miRNA-217、miRNA-646低表达，且与患者的临床分期、预后相关[10]。

自从第一次报道了miRNA在肺癌中的表达后[11]，随后有大量涉及miRNA与肺癌的研究。miRNAs参与肺癌的多种生物学行为，包括细胞增殖、迁移、侵袭与凋亡[12]。研究已证实，在肺癌中miRNA表达谱、肺组织中的特异miRNA表达与疾病预后和临床结局相关，miR-221、miR-222、miR-449a、miR-21、miR-205、miR-10b、miR-143、miR-181a在NSCLC组织中表达失调，是肿瘤发生的潜在重要因子[13]。Mavridis等[14]研究表明，miR-197在NSCLC中高表达与患者肿瘤大小、鳞癌组织学类型相关，并且miR-197高表达是患者不良预后的独立预测指标。miR-148b在NSCLC组织中低表达，其表达状态与患者TNM分期、淋巴结转移、远处转移相关，Kaplan-Meier生存分析发现miR-197在NSCLC组织中低表达可作为一个独立预测生存指标[15]。

研究显示，miR-200b在多种肿瘤组织中表达失调，并与患者的疾病进展和临床预后相关。Tang等[16]研究发现miR-200b在胃癌组织中低表达，并与患者临床分期、淋巴结转移以及预后相关。Cao等[17]显示，miR-200b在卵巢癌中高表达与患者的临床分期、组织分化程度及预后生存相关。miR-200b在乳腺组织和细胞中表达下调，并且其表达状态与乳腺癌患者的TNM 分期和ER受体阴性、HER-2阳性表达相关，多变量分析发现miR-200b在乳腺癌中低表达可作为一个独立预后指标[18]。miR-200b在胶质瘤组组中低表达，其低表达与Ⅲ～Ⅳ期患者的无病生存期和总生存期相关，且miR-200b可作为患者预后的独立预测因子[19]。

本研究采用原位杂交技术在88例NSCLC组织与癌旁正常组织中检测miR-200b的表达，发现miR-200b在NSCLC组织中的表达相比癌旁正常肺组织明显下调。经相关性分析发现，miR-200b表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移明显相关。Kaplan-Meier生存曲线统计分析显示， miR-200b低表达者病死率高于miR-200b高表达者，中位生存时间短于高表达者。提示miR-200b表达越低，NSCLC患者预后越差，表明miR-200b表达高低与NSCLC患者预后有关。由此可见，在NSCLC患者中miR-200b低表达可能是NSCLC发生发展的重要生物学指标之一。因此，检测miR-200b在NSCLC组织中的表达差异，可作为判断NSCLC患者病情进展和预后的参考依据。

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湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015477)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.016

R734.2

B

1002-266X(2017)05-0051-03

2016-07-19)