蜡样芽孢杆菌及其芽孢的杀菌技术和动力学研究进展

胡思卓,占文婷,徐圆融,王丹凤,焦顺山

(上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系,上海 200240)

蜡样芽孢杆菌及其芽孢的杀菌技术和动力学研究进展

胡思卓,占文婷,徐圆融,王丹凤,焦顺山*

(上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系,上海 200240)

蜡样芽孢杆菌是易造成食源性疾病爆发的污染菌之一。本文重点介绍了蜡样芽孢杆菌的几种新型食品杀菌技术及几种常用的动力学模型,其中,新型杀菌技术包括:高温瞬时杀菌、射频加热、高静压以及高压脉冲电场等;动力学模型包括:线性和非线性模型。并对蜡样芽孢杆菌及其芽孢在不同介质、杀菌方法及条件的杀菌动力学模型参数分别进行总结。因此认为传统均匀加热的杀菌动力学为线性模型,而高新技术的杀菌动力学通常为非线性的,非线性模型中最常用的两个模型为Weibull模型和Log-logistic模型。

蜡样芽孢杆菌,动力学,模型,芽孢

蜡样芽孢杆菌是一种无荚膜、能运动、产芽孢,兼性好氧的革兰氏阳性杆菌[1],广泛分布于各种食品。作为一种常见的微生物,食品极易被蜡样芽孢杆菌污染,Andersson等人[2]指出当食品中蜡状芽胞杆菌数大于103CFU/g时,对消费者即产生潜在的危害,包括恶心、呕吐、腹泻等[3]。造成该症状的毒素主要分为两种,呕吐毒素(cereulide)和腹泻毒素(非溶血肠毒素(Nhe)、溶血素BL(Hbl)、细孢毒素K(CytK)等)[4]。蜡样芽孢杆菌的细孢壁较厚,可产生内孢子,因此该菌及其芽孢对热、辐射和毒性化合物有较强的抗性从而难以被杀灭。毛雪丹等[5]对国家食源性疾病监测网的数据分析,统计得到我国每年发生数十起蜡样芽孢杆菌食物中毒事件,约占细菌性食物中毒总数量的11.4%,造成数百人发病,其中尚不包括症状轻微而被误诊为腹泻或其他疾病的食物中毒事件。

传统热加工是当前广泛应用于食品杀菌的技术之一。高温可以杀灭微生物的营养体,对于极耐热或产芽孢的病原微生物,则需要更高的杀菌温度和更长的处理时间。然而,杀菌温度的高低和时间的长短对食品营养成分及风味物质有较大的影响。因此,近些年除传统热加工方法外,越来越多的食品高新加工技术[6-8]被应用到微生物杀菌,如射频、高静压、高压脉冲电场、电子辐射,超声波等技术;这些杀菌技术与传统加热联合或添加抗菌、抑菌剂可提高杀菌效果,这样既可缩短处理时间,又可减少杀菌处理对食品品质的影响。但是,目前对蜡样芽孢杆菌及其芽孢杀菌动力学研究进展缺少相关综述,因此,本文着重介绍了几种新型的针对蜡样芽孢杆菌及其芽孢的杀菌方法,并系统概述了其杀菌动力学模型研究进展以及相关模型参数,为后续研究提供思路及借鉴。

1 蜡样芽胞杆菌的常用杀菌技术

1.1 热杀菌技术

1.1.1 传统热杀菌技术 传统热杀菌技术就是采用热水和(或)热蒸气等传统加热方法,在食品外部提供热源,经热传导或热对流使热能由外到内传递到食品内部,因而达到杀菌的目的。最常见的热杀菌方法有巴氏杀菌法(Pasteurization)和高温灭菌(Sterilization)[9]。

巴氏杀菌法是一种利用较低的温度既可杀死致病菌又能保持食品中营养物质风味不变的杀菌方法,广义上用于定义需要杀死各种病原菌的热处理方法。在乳制品的工业生产中,巴氏杀菌法是最主要的杀菌方法,一种是将牛奶加热到62～65 ℃,保持30 min。另一种方法将牛奶加热到75～90 ℃,保温15～16 s,其杀菌时间更短,工作效率更高[10]。高温灭菌是指杀死食品中含芽孢在内的几乎全部微生物的杀菌方法。在乳制品加工中,一般采用110 ℃处理30 min。但长时间高温处理,会导致乳制品中的某些蛋白变化及维生素含量降低[11]。

1.1.2 其他热杀菌技术 超高温瞬时杀菌(Ultra-high temperature sterilization,UHT),常用的方法是使牛乳在135～150 ℃的加热条件下保持2～5 s[12]。UHT乳经过超高温处理无菌包装后,基本能够达到商业无菌的状态。同样,过高的温度使牛乳中的营养物质如维生素等遭到很大破坏,又会使牛奶中的钙形成不溶物,不易于人消化吸收[12]。

射频(Radio frequency,RF)是一种高频交流电磁波,其频率范围在3～300 MHz之间,工业上常用射频频率为13.56、27.12和40.68 MHz[13]。射频具有很强的穿透力,通过物料内部离子振荡和极性分子转动产生摩擦从而在物料内部产生热能,使物料温度升高。因此,射频加热具有快速和整体加热的特点。该技术早期在食品加工领域主要应用于肉类解冻及饼干后期焙烤,后来集中于对农产品的杀虫及干燥方面的研究。目前,射频加热在食品杀菌方面的应用逐渐成为国内外的研究热点。

Byrne等[14]把蜡样芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌细胞及孢子接种到午餐肉中,经射频处理后,蜡样芽孢杆菌和其孢子数量分别减少了5.4和1.8 lg CFU/g,蜡样芽孢杆菌在60 ℃、其芽孢在95 ℃的D值分别为1 min和2 min。Byrne等又对不同条件下射频处理对产品品质影响进行研究,研究结果表明可通过调整产品配方以达到理想的杀菌效果并减少对产品品质的影响。Schlisselberg等[15]将表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌以及蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的芽孢接种于肉丸,对比研究射频加热和传统对流加热对碎肉中病原微生物的杀菌效果。分别用83 ℃ 55 min的对流加热和83 ℃ 12 min的射频处理对蜡样芽孢杆菌芽孢进行单次处理时发现,两种处理方法对芽孢的致死率影响不大,因此,在上述处理基础之上分别又各自进行73 ℃ 40 min的对流加热、73 ℃ 7.5 min的射频处理以及83 ℃ 9 min的热风辅助射频处理。研究结果显示,二阶段的处理方式最大可使芽孢减少4.5 lg CFU/g。

1.2 非热杀菌技术

1.2.1 高静压 高静压(High hydrostatic pressure,HHP)技术是一种非热杀菌技术,与传统热杀菌技术相比,不仅可以有效杀灭食品中的微生物,延长保藏期,且能较好地保持食品中天然的营养成分和风味[16-17]。而对芽孢来说,由于芽孢具有极耐热、抗压、抗辐射和抗化学药物等性质,普通高静压处理很难杀灭芽孢。因此,许多研究提出高静压与温度、pH等结合以达到更好的杀菌效果。

Fujii[18]研究了高压对接种于含氩气的水中的蜡样芽孢杆菌芽孢的灭活效果,发现无论是否有氩气的添加,芽孢致死率随压强的增加而明显增大,600 MPa条件下,其致死率随温度上升而增大。黄训端等[19]采用响应曲面法研究了高静压处理对蜡样芽孢杆菌的杀菌效果,并利用Design Expert软件建立了致死率的响应模型,方差分析及显著性检验结果表明压力、温度、时间以及压力与温度的交互作用对致死率有显著影响。

1.2.2 高压脉冲电场 高压脉冲电场(Pulsed electric field,PEF)处理是对两电极间的流态物料反复施加高电压的短脉冲(典型为20～80 kV/cm)进行处理的过程,具有处理时间短、升温小、能耗低、杀菌效果明显、能有效保存食品营养成分和天然色、香、味等特征[20]。它在食品加工过程中主要作为一种非热的食品加工方法,目前已成为食品杀菌研究中最为活跃的技术之一。

Bermúdez-Aguirre等[21]通过高压脉冲电场处理牛奶中的蜡样芽孢杆菌芽孢,分别研究了电场、温度、脉冲数、脉冲宽度、脉冲频率以及乳酸链球菌肽浓度对脱脂奶和全脂奶中芽孢杀菌效果的影响。结果显示,常温下用高压脉冲电场处理芽孢,芽孢表现出高耐受性。40 ℃的加热和高压脉冲电场的联合处理对芽孢的致死率具有拮抗作用,而在65 ℃较高温度条件下与高压脉冲电场联合处理可明显增加芽孢致死率。在不同的介质之中,脱脂奶中芽孢的杀菌效果比全脂奶的更好。浓度为50 IU/mL的乳酸链球菌肽的添加与高压脉冲电场条件为电场强度40 kV/cm,脉冲数144,65 ℃对脱脂奶中的芽孢具有协同杀菌效果,其芽孢数减少量为3.6 lg CFU/g。Pina-Pérez等[22]用高压脉冲电场处理添加抗菌可可粉的全蛋液脱脂牛奶和脱脂牛奶以及没有添加抗菌可可粉的全蛋液脱脂牛奶和脱脂牛奶,然后分别在5 ℃放置15 d,其两款饮料的蜡样芽孢杆菌最大减少量在3.0 lg CFU/g左右,最佳杀菌条件为电场强度40 kV/cm,时间360 μs,20 ℃。而添加抗菌可可粉的饮料的杀菌效果更好,其蜡样芽孢杆菌减少量为3.3 lg CFU/g。对比储藏15 d后的添加抗菌可可粉的饮料和未添加的抗菌可可粉的饮料,添加量为12%样品中的蜡样芽孢杆菌减少量为4.0 lg CFU/g,并得出高压脉冲电场和抗菌剂的联合处理对杀菌有协同作用。

2 常用动力学模型

动力学模型可以用来模拟并预测微生物数量的变化,对开发杀菌技术工艺具有重要指导意义。传统热杀菌方法可以用一次线性模型进行模拟,然而,随着一些新型杀菌技术的出现,非线性的动力学模型也逐渐被大量研究应用,如Weibull模型,Log-Logistic模型等。

2.1 线性模型

在线形模型中,微生物存活率的对数与处理时间呈负线性相关。D值(Decimal reduction time)是指在一定的处理环境中和在一定的热力致死温度条件下某细菌数群中每杀死90%原有残存活菌数时所需要的时间[23]。D值越大,细菌的死亡速率越慢,即该菌的耐热性越强。因此D值大小和细菌耐热强度成正比。

式(1)

N0是初始菌或芽孢数(CFU/mL或CFU/g),是暴露在热或其他处理条件下特定时间t(min)后菌或芽孢的存活数。Z值是杀菌的致死时间曲线的斜率(min),即对温度变化时致死时间相应变化,为致死时间或致死率(D)按照1/10或10倍变化时相应的加热温度变化[24]。Z越大,因温度上升而取得的杀菌效果就越小。

式(2)

其中,Dref是参考温度Tref下的D值。

2.2 非线性模型

2.2.1 Weibull模型 Weibull分布是一种用于描述各种线性和凹凸型曲线的非线性模型[25]。

式(3)

其中,N0和N分别是初始和暴露在热或其他处理条件下特定时间(t,min)后微生物或芽孢的数量(CFU/mL或CFU/g);b、n分别为规模参数和形状参数;n表示的是存活曲线的形状,当n=1,该图像为一条直线,n<1,曲线向上凹陷形成拖尾,n>1,曲线向下凸出。

2.2.2 Log-Logistic模型 该模型最早应用于单增李斯特菌的热致死过程,证明残活菌数随处理时间的对数下降规律遵循该动力学模型。Log-Logistic模型是考虑到各类微生物对杀菌工艺条件的敏感性不同而建立的[26],Log-Logistic模型为:

式(4)

其中N0,N和分别是初始和暴露在热或其他处理条件下特定时间(t,min)后微生物或芽孢的数量(CFU/mL或CFU/g);α、ω分别表示N0的上、下渐近线,σ为微生物最大失活率(%),τ为微生物最大失活率所对应的时间对数值。

2.2.3 Modified Gompertz模型[22]Modified Gompertz模型最早是在Gompertz方程的基础上提出来用于生长曲线的建模[27],而后用于灭菌动力学的建模[28],其方程如下:

式(5)

其中,M是达到最大绝对死亡率所用的时间(min);B((CFU/mL或CFU/g)/min)是在最大绝对死亡率下的相对死亡率;C为上下渐近线的差值。

整个安葬过程，阿里都很乖。罗四强保镖一样贴身随他。他一躁乱，罗四强就放手机里的哀乐。阿里一听到哀乐，就会静下。罗四强说：“这是你姆妈睡着的声音。”阿里便会大声地“哦”上一声，表示明白，于是又安静一阵。

2.2.4 Biphasic模型

logN=logN0+log[f(e-kmax1)t]+[1-f(e-kmax2t)]

式(6)

该模型将初始菌或芽孢分为大多数敏感型和少数耐受型两种亚群,kmax1和kmax2分别为两类菌特定灭菌率,该方程可以写成两个一阶微分方程的形式[29]。Shadbolt等[27]在由水分活度和pH对热灭活影响的研究中即用到该模型。在Biphasic模型中,大多数微生物个体属于敏感型,因此kmax1比kmax2的值大。而且,四倍D值的概念的应用可以很好地反应出各种物理化学因素对微生物灭活速率的影响[29]。

2.2.5 Double Weibull模型

式(7)

Double Weibull模型[30]是在微生物对菌群压力耐受性符合Weibull模型的基础上建立的,与Weibull模型相比,双Weibull模型被简化后含有五个参数,但是只有其中三个参数(δ1,δ2和α)和细胞生理状态以及环境因素有关。因此,Double Weibull模型具有更灵活的特点,可以用于描述双相非线性图形和双相线性模型[30]。

3 杀菌动力学研究现状

3.1 蜡样芽胞杆菌的污染现状

蜡样芽孢杆菌广泛存在于自然环境中,从食品原料本身到加工过程中都可能存在不安全因素造成食品污染。在以往蜡样芽孢杆菌污染的研究中发现,乳制品的污染是最严重的。赵月明等[1]对我国乳制品中蜡样芽孢杆菌污染情况进行了总结及分析,结果显示我国多个地区的乳制品中存在不同程度的污染,其阳性率高达81.8%。除此之外,粮食类[31]、肉制品以及婴幼儿辅食[32]中也存在蜡样芽孢杆菌污染的潜在危害。美国在对1998～2008年共235起蜡样芽孢杆菌中毒事件研究后发现50%的食源性疾病是由米饭引起,其次是肉类和禽类食品,占23.68%[33]。从表1～表3可以看出,各种蜡样芽孢杆菌及芽孢的杀菌技术和动力学研究主要集中于乳制品、肉制品和米饭等,其中,乳制品的杀菌研究占50%左右,这与早期蜡样芽胞杆菌污染情况研究一致。

表1 不同食品介质中蜡样芽孢杆菌的杀菌动力学模型及参数Table 1 The pasteurization kinetic models and parameters of Bacillus cereus in different food media

Asselt等[34]从文献中收集了484个蜡样芽孢杆菌的热杀菌样本,通过线性回归在95%的置信区间内得到蜡样芽孢杆菌和嗜热蜡样芽孢杆菌的D120和Z的保守估计值分别为0.04±0.52、(3.39±34.67) min和12.8、12.1 ℃。表1显示蜡样芽孢杆菌在50～60 ℃范围内的D值在1～33.2 min之间,其中D55和D50分别为6.4 min和33.2 min,可见D值在该温度范围内变化较大。而芽孢由于具有较强的耐热性,因此研究过程选用较高的温度(通常为80～100 ℃)。不同文献中的D值和Z值具有较大的差异性,这可能跟菌株差异性、加热介质不同等有关,其中加热介质的差异包括牛奶中的脂肪含量、水分活度、pH等。如:ATCC 9818在脱脂奶和含20%脂肪的牛奶的D98值分别为9.4 min和6.1 min[35];以pH为5.5的柠檬酸缓冲液为介质的CNRZ 110为例,水分活度为0.98、0.86的上述条件下的D95值分别为1.7 min和14.5 min[36]。

早期研究产芽孢菌的耐热性都是建立在所有芽孢受热均匀的基础之上[37]。因此,微生物致死率和处理时间的关系可以用D值来表示,D值越大,该菌的耐热性越强。由于D值和处理时间也存在线性关系,因而引出Z值的概念来表示微生物的热耐受性。Z值越大,因温度上升而取得的杀菌效果就越差,微生物的热耐受性越强。但是,很多热处理热耐受性强的微生物或是在使用某些高新杀菌技术的时候,存活率和处理时间并不都是线性关系,而是存在“拖尾”或者“肩部”现象。尤其在非等温条件下对微生物的热致死过程的描述,需要寻找精确度更高的动力学模型,期望能够替代现有基于一级动力学方程的D值模型。已有研究采用Weibull分布模型拟合前人文献报道中的微生物致死历程的数据,证明Weibull方程优于一级动力学方程[38-43]。将Weibull模型引申于描述加热过程对酶、色素和营养素等成分的降解动力学研究,与采用的一级动力学方程比较,Weibull模型具有更高的精确性[39,41]。

3.3 新型杀菌技术与动力学模型的应用

目前,除传统热杀菌技术外,射频、高静压、高压脉冲电场、电子辐射等技术在蜡样芽孢杆菌及芽孢杀菌方面的研究也有一定的发展。这些技术一方面集中于各技术对蜡样芽孢杆菌及芽孢的灭菌效果,以及与传统热处理加工在杀菌效果和食品感官性状的对比研究。另一方面则是在已有的杀菌效果研究基础上探讨蜡样芽孢杆菌及芽孢的杀菌动力学,分析蜡样芽孢杆菌及芽孢的致死率与时间的线性及非线性关系。尽管超高压杀菌技术对某些水分含量极低的食品物料,红外线杀菌技术对不易穿透的物料的杀菌效果不甚显著[46-47],但是,综合考虑高新加工技术在各种食品灭菌技术的应用情况,与传统热加工相比大多数高新加工技术对蜡样芽孢杆菌及芽孢的杀菌效果更好,且对食品本身的营养成分及感官性质影响较小。

以Fernandez等[37]所做研究为例,该研究分别用线性模型和Weibull模型对蜡样芽孢杆菌的存活线进行拟合,两株菌的相关拟合参数如表2～表3所示。拟合后通过新的一组实验来比较Weibull模型和线性模型预测值和实际值的差异,从而来验证两个模型拟合效果。结果显示,Weibull模型的预测值比线性模型的预测值更接近于实际值。

续表

同样的研究在高静压对两组嗜冷芽孢的杀菌动力学研究中也发现,在同样的条件下,Weibull模型的拟合度比线性模型的拟合度高[24];但是Staack[48]等在研究温度、pH、水分活度对近红外辐射处理辣椒粉中的蜡样芽孢杆菌的芽孢的影响时,尽管非线性模型更符合芽孢的存活曲线,但是作者仍选择一级动力学模型,因为,D值、Z值的结果更有利于直观分析处理方法对芽孢的灭菌情况。Evelyn等[24]在研究高静压和热处理对芽孢的杀菌效果时发现,单纯只用高静压处理而不升高温度的条件下杀灭芽孢的效果并不理想,但是在300～700 MPa的压强下适当升高温度发现对耐热型芽孢有非常好的杀菌效果。通过对线性模型、Weibull模型和Log-logistic模型分别拟合后发现,两株菌在高静压结合热处理条件下,芽孢存活曲线的Weibull模型比Log-Logistic模型拟合度更高。而常压热处理条件下的芽孢存活曲线更符合一级动力学模型。

从以上综述可以看出,研究蜡样芽孢杆菌及芽孢这种耐受性高的微生物杀菌动力学模型时,首先从线性模型出发,通过与其他杀菌研究的模型参数D值、Z值的对比,对微生物的耐受性有一个粗略评价。线性模型拟合度较差的情况下,一方面可以选用曲线的线性部分进行线性拟合,另一方面可以用常用的Weibull模型和Log-Logistic模型对微生物的整个杀菌过程进行拟合分析。而对其他一些不常用的非线性模型而言,可在上述模型拟合不理想的情况予以尝试。

表3 不同食品介质中蜡样芽孢杆菌芽孢的动力学模型及参数(非线性)Table 3 The nonlinear model and parameters of Bacillus cereus spores’pasteurization kinetics in different food media

4 结论与展望

蜡样芽孢杆菌作为一种条件致病菌,目前,研究者对它的污染来源、微生物特性、检测方法以及杀菌方法等方面已做了大量研究,这对于减少蜡样芽孢杆菌的危害具有重要的意义。但是目前在某些高新加工技术在不同介质中的蜡样芽孢杆菌及芽孢的杀菌动力学研究还是不够深入和详细,尤其对于不同水分活度、不同组分的食品以及具有抑菌、抗菌、抗氧化等成分的添加对杀菌动力学的影响。相信随着研究的深入,蜡样芽孢杆菌及芽孢的杀菌技术将得到进一步的提升。

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Research progress of pasteurization methods and kinetics study ofBacilluscereusand its spores

HU Si-zhuo,ZHAN Wen-ting,XU Yuan-rong,WANG Dan-feng,JIAO Shun-shan*

(Department of Food Science and Engineering,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

Bacilluscereusiswas one of the most common contaminating microorganisms which cause outbreak of foodborne disease. In this paper,several novel food pasteurization technologies and kinetic models were introduced. The technologies covered ultra-high temperature sterilization,radio frequency,high hydrostatic pressure and pulsed electric field. While the kinetic models included linear and nonlinear model. Additionally,the summary of pasteurization kinetics model ofBacilluscereusand its spores in different media by different methods were also reviewed.Conclusively,the linear model more fitted traditional pasteurization heating. While nonlinear model did better in novel technologies,including Weibull model and Log-logistic model that were the most common.

Bacilluscereus;kinetic study;model;spores

2016-07-05

胡思卓(1992-),女,硕士研究生,研究方向:食品加工与贮藏,E-mail:yuzhuo20081992@sjtu.edu.cn。

*通讯作者:焦顺山(1983-),男,博士,副教授,研究方向:食品加工与贮藏,E-mail:sjiao@sjtu.edu.cn。

国家自然科学基金青年项目(31401538);教育部第48批留学回国人员科研启动基金;上海交通大学青年教师科研启动基金。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0370-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.062