分光光度法测定龟苓膏中总黄酮含量不确定度评定

莫启进,卓梅芳,朱海军

(1.梧州学院化学工程与资源再利用学院,广西梧州 543002;2.梧州市产品质量检验所,广西梧州 543002)

分光光度法测定龟苓膏中总黄酮含量不确定度评定

莫启进1,卓梅芳1,朱海军2

(1.梧州学院化学工程与资源再利用学院,广西梧州 543002;2.梧州市产品质量检验所,广西梧州 543002)

对分光光度法测定龟苓膏中总黄酮的含量进行不确定度评定。依据CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》和JJF 1059-2012《测量不确定度评定与表示》的规定和实验方法,建立数学模型,对检测过程中可能引入的不确定度因素包括标准溶液配制、样品处理、标准曲线拟合、样品重复测定和仪器进行分析和评定。结果表明,标准曲线拟合和标准溶液配制引起的不确定度是不确定度的主要来源。

分光光度法,总黄酮,不确定度,龟苓膏

龟苓膏是以凉粉(淀粉、凉粉草提取液)、土茯苓(茯苓)、乌龟、蒲公英和金银花为主要原料制作而成的一种岭南传统保健食品,主产于广西梧州,具有清热祛湿,旺血生肌,润肠通便,滋阴补肾等众多药用价值[1],深受两广、港澳台及东南亚人民的青睐。龟苓膏含有丰富的黄酮类化合物[2],黄酮类化合物对人体具有缓解疲劳、降血脂降血糖、促进毛细血管扩张、抗菌消炎、抗癌、抗衰老、雌性激素样作用等功效[3-6]。总黄酮作为龟苓膏主要的质量控制指标,准确测定其在龟苓膏中的含量,对保障龟苓膏的品质具有重要的现实意义。芦丁有典型的黄酮类结构,且廉价易购,较多文献报道以芦丁作为对照品用于测定凉粉草、土茯苓、蒲公英和金银花中的总黄酮含量[7-11]。

不确定度是体现被测量值合理分散性,是与测量结果相联系的参数,是当代误差理论定量描述测量结果质量的重要指标[12]。依据CNAS-GL06《化学分析中不确定度的评估指南》[12]和JJF 1059-2012《测量不确定度评定与表示》[13]的原理和方法,对采用分光光度法测定龟苓膏中总黄酮过程中不确定的来源进行评定分析,以保证总黄酮含量测定方法的可靠性及测定结果的可信程度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原味梧州龟苓膏 广西梧州双钱实业有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇等试剂 均为分析纯;芦丁标准品 批号:100080-201408,含量测定用,纯度为92.8%±0.5%,中国药品生物制品检定所;水 超纯水。

UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津;XA205DU 十万分之一电子天平 梅特勒-托利多;YP6002电子天平 常州衡正电子仪器有限公司;P300H超声清洗器 德国Elmasonic;DZG-303A纯水超纯水系统 广州品业仪器设备有限公司;TG16-WS台式高速离心机 相仪离心机仪器有限公司;所有用到的玻璃仪器 均为天波牌A级。

1.2 实验方法

本实验方法参照相关标准[14],对试样中总黄酮含量进行测定。

1.2.1 总黄酮标准溶液的配制及标准曲线绘制 精密称取于120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品10.49 mg,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液适量,超声溶解,加60%乙醇至刻度,摇匀,精密量取5.0 mL置于25 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液至刻度线,摇匀,此为标准品母液。精密量取标准品母液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇使容量瓶中溶液共10 mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加10%硝酸铝溶液1.0 mL,摇匀,放置6 min,加1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL,再加水至刻度线,摇匀,放置15 min,以相应的试剂做空白,在510 nm下测定吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2 样品前处理 取龟苓膏试样适量搅拌成均匀的浆体,称取试样20.02 g(准确至0.01 g)于烧杯中,用25 mL无水乙醇稀释后转移至100 mL容量瓶,烧杯另用35 mL无水乙醇分多次清洗并转移至该容量瓶中;超声提取30 min,放冷,加水至刻度,摇匀,转入离心试管,离心,取上清液作为供试品溶液。

1.2.3 样品测定 精密量取1.2.2中的供试品溶液10.00 mL样品溶液两份,分别置于25 mL容量瓶中(处理步骤同1.2.1)。以空白溶液调零,在510 nm波长处测定样品吸光度,代入标准曲线方程求出样品溶液中总黄酮的浓度。

1.3 龟苓膏样品中总黄酮含量计算数学模型

龟苓膏样品中总黄酮含量计算:

式中:X为试样中总黄酮含量(mg/kg);Cx为由标准曲线计算出的被测液中总黄酮质量浓度(mg/mL);m为称取的龟苓膏样品质量(g);V1为样品提取液定容的总体积(mL);V2为从提取液V1中分取的体积(mL);V3为实验被测液最终定容的体积(mL)。

1.4 不确定度来源分析

根据实验方法和数学模型可知，影响总黄酮含量的不确定度的来源包括以下几个方面:标准溶液配制引入的不确定度Urel(1);样品处理过程引入的不确定度Urel(2);标准曲线拟合引入的不确定度Urel(3);样品重复测定引入的不确定度Urel(4);仪器引入的不确定度Urel(5)。

2 结果与分析

2.1 总黄酮标准品溶液配制引入的不确定度

芦丁标准溶液配制引入的不确定度包括标准品称量、标准品纯度、标准溶液配制体积引入的不确定度。

2.1.2 芦丁的纯度引入的相对不确定度 芦丁的纯度为P(C27H30O16)=92.8%±0.5%,假设是矩形分布[12],相对不确定度为:

标准溶液配制使用10 mL容量瓶、25 mL容量瓶、10 mL分度吸量管、5 mL单标液移液管和10 mL单标线移液管。由表1可得标准溶液配制体积引入的不确定为:

Urel(Vb)=[U(V1)2+U(V2)2+U(V4)2+U(V5)2+U(V6)2]1/2=[(8.94×10-4)2+(6.09×10-4)2+(2.07×10-3)2+(1.27×10-3)2+(8.94×10-4)2]1/2=2.80×10-3

2.1.4 合成标准溶液配制的相对不确定度 计算式如下:

Urel(1)=[(7.70×10-3)2+(3.11×10-3)2+(2.80×10-3)2]1/2=8.76×10-3

2.2 样品处理过程引入的不确定度

样品处理过程引入的不确定度包括样品称量引入的不确定度;样品溶液制备体积引入的不确定度;样品经产生、转移、离心等前处理引入的不确定度,可采用回收率实验对其不确定度进行评定。

表1 玻璃量具引入的不确定度Table 1 Uncertainties aroused from error in calibration of volumetric flask and pipettes

表3 龟苓膏中总黄酮测定结果Table 3 Determination results of total flavonoids in guilinggao

2.2.2 样品处理体积引入的不确定度 根据1.2.2和1.2.3对样品进行处理和测定。使用100 mL容量瓶,10 mL单标线移液管,25 mL容量瓶,由表1中对应玻璃器具引入的不确定度可得样品处理体积引入的不确定度为:

Urel(Vy)=[U(V2)2+U(V3)2+U(V6)2]1/2=[(6.09×10-4)2+(5.47×10-4)2+(8.94×10-4)2]1/2=1.21×10-3

2.2.3 回收率实验引入的不确定度 称取同一试样6份,进行加标实验,按照样品测量过程进行测定,6次回收率测定结果为100.69%、98.95%、99.86%、99.23%、97.25%、97.33%,平均值为98.89%,标准偏差为1.37%。回收率实验相对不确定度为:

2.2.4 合成样品处理及测定过程引入的不确定度为:

Urel(2)=[(2.88×10-4)2+(1.21×10-3)+(5.66×10-3)2]1/2=5.79×10-3。

2.3 标准曲线拟合过程引入的相对不确定度

配制5个不同浓度的标准溶液,在510 nm波长下,每个浓度测定3次吸光度,结果见表2。

表2 标准曲线测定结果Table 2 Date for preparing standard curve

以表2中浓度为横坐标,吸光度平均值为纵坐标,以最小二乘法进行拟合得标准曲线回归方程及相关系数为:A=aC+b=13.903C-0.0191,r=0.9997。

将龟苓膏样品分为样品1与样品2,每一样品溶液重复测定三次吸光度,结果如表3所示。

由标准曲线求Cx时引入的相对不确定度Urel(3)为:

拟合曲线的标准偏差:

=3.30×10-2

2.4 样品重复测定引入的不确定度

按照同一实验方法对同一龟苓膏样品进行6次平行测定,测得结果分别为113.9、113.4、113.6、113.4、114.4、114.7 mg/kg,测定结果的平均值为113.9 mg/kg,测定结果的标准偏差为0.544 mg/kg,相对标准不确定度为:

2.5 仪器引入的不确定度

分光光度计测定吸光度重现性引入的不确定度:对6份样品溶液进行吸光度测定,每份测定3次,得到18个吸光度数据,测得含量平均值为0.2278 mg,各次实验的标准偏差为0.0019,则吸光度测量重现性引起的标准不确定度U2(UV)=0.0019。仪器引入的相对标准不确定度为:

2.6 合成标准不确定度

将以上各分量不确定度结果统计见表4。

表4 测量不确定度分量表Table 4 List of uncertainty components

由表4可得,相对合成标准不确定度为:

实验测得某一龟苓膏样品中总黄酮的平均含量为99.75 mg/kg,则测量结果的合成标准不确定度为:Urel(w)=99.75×3.48×10-2=3.47(mg/kg)

2.7 扩展不确定度

在95%的置信区间下,扩展不确定度包含因子k=2,则将合成标准不确定度乘以包含因子即得测量结果的扩展不确定度为:U(w)=2×3.47 mg/kg=6.94 mg/kg。该龟苓膏样品中总黄酮含量可表示为(99.75±6.94) mg/kg,k=2。

3 结论

龟苓膏中总黄酮含量的测量不确定度由标准溶液配制、样品处理、标准曲线拟合、样品重复测定及仪器五部分组成。标准曲线拟合和标准溶液配制是不确定的主要来源,标准曲线拟合在不确定度合成中贡献最大,而样品处理、样品重复测定、仪器对测定结果影响较小。在实际检测过程中应严格控制外标法定量,加强对标准曲线的拟合过程控制,加强标准操作训练,减少人为因素对标准溶液配制和标准曲线校准过程的影响,在绘制标准曲线时,增加实验点可降低分析结果的测量不确定度。

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Uncertainty evaluation for the determination of total flavonoids in guilinggao by spectrphotometry

MO Qi-jin1,ZHOU Mei-fang1,ZHU Hai-jun2

(1.College of Chemical Engineering and Resource Recycling,Wuzhou University,Wuzhou 543002,China;2. Wuzhou Institute of Product Quality Inspection,Wuzhou 543002,China)

The uncertainties evaluation of total flavonoids content in guilinggao was determined by spectrphotometry. Based on CNAS-GL06 guidance on evaluation the uncertainty in chemical analysis and JJF 1059-2012 evaluation of the uncertainty of deterrmination and expressin and the test method,a mathematical model was established to analyze and evaluate the possible uncertainties such as stock solution,sample treatment,standard curve fitting,measurement repeatability and instrument in the determination. The results showed that the major factors of uncertainty were the standard curve fitting and preparation of standard solution.

spectrphotometry;total flavonoids;uncertainty;guilinggao

2016-08-29

莫启进(1982-)，男，博士，工程师，研究方向：食品质量检测与安全评价，E-mail：qjmo@qq.com。

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能14123006-25)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)04-0077-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.006