用于组胺检测的新型电化学传感技术研究

姜随意，吴业宾，王浩，宁保安，白家磊，彭媛，高志贤，*

（1.解放军61251部队卫生队，河北秦皇岛066102；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

用于组胺检测的新型电化学传感技术研究

姜随意1，吴业宾1，王浩1，宁保安2，白家磊2，彭媛2，高志贤2，*

（1.解放军61251部队卫生队，河北秦皇岛066102；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

通过对检测条件的优化，制备高特异性、高稳定性、高敏感的MIP-AuNPs-GCE电化学传感器，建立新型的组胺检测方法。通过对该传感器的电极电化学行为进行研究，分析出了电极电化学行为的变化规律，还对AuNPs的信号放大作用进行了验证。该方法的检测时间＜30min，标准曲线为：Y=2.953 lg X+1.968，R2=0.998 8，最低检测限（LOD）：0.22 ng/mL，检测范围：0.25 ng/mL～100 ng/mL。以豆腐乳作为实际样品进行加标回收试验，加标回收率位于93.57%～103.93%之间，相对标准偏差（RSD）位于0.93%～3.08%之间，各检测水平之间的差异具有统计学意义。

组胺；电化学传感技术；分子印迹膜；AuNPs信号放大

组胺是一种生物胺，有毒性，食品的腐败变质会产生大量的组胺[1-3]，组胺的检测方法很多，但大多数方法都较为复杂、费时、费力，而且检测灵敏度、检测范围还可以进一步提高[4-6]，为了进一步简化操作程序、节约检测时间、提高检测灵敏度和扩大检测范围，我们建立了新型的MIP-AuNPs-GCE电化学传感技术用于检测组胺。

该传感器是将电化学传感技术、纳米材料制备技术与MIP材料制备技术相结合构建的电化学传感器，首先在玻碳电极上电化学沉积AuNPs起到信号放大作用，更重要的是还可以共价修饰引发剂AIBA，然后以组胺作为模板分子制备MIP膜，建立的MIP-AuNPs-GCE电化学传感器可以进行信号放大用于检测组胺，该方法检测组胺具有检测范围宽、灵敏度高、操作步骤简单等优点，经反复再生后仍能多次重复地使用，应用该传感器我们成功地实现了对实样中的组胺进行检测，取得比较理想的效果，该传感技术在食品安全的应用具有很大的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯金酸（1g/100mL）：美国Sigma-Aldrich公司；铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）、亚铁氰化钾（K4[Fe（CN）6]·3H2O）：天津赢达稀贵化学试剂厂；11-巯基十一烷酸（MUA）、甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、组胺标准品（Histamine）、2，2-偶氮双（2-甲基丙脒）盐酸盐（AIBA）：美国Sigma–Aldrich公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：阿拉丁试剂上海有限公司；结构类似物组胺酸、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙酸、1-咪唑乙酸：百灵威科技有限公司；其它所有试剂均为国产分析纯；试验用水为天津卫生学环境医学研究所军队卫生检验学研究室自制18.3MΩ·cm超纯水。

1.2 仪器与设备

电化学工作站：荷兰IVIUM TECHNOLOGIES BV公司；Ag/AgCl电极（饱和KCl，参比电极）、铂片电极（对电极）：上海辰华仪器有限公司；玻碳电极、金电极（直径3mm，工作电极）：天津艾达恒晟科技发展有限公司；AL-204分析天平：美国METTLER TOLEDO；PB-10-pH计：德国Sartorius集团；Quanta 200FEG场发射环境扫描电子显微镜：美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 玻碳电极的处理

取少量Al2O3粉置于麂皮上，加少量超纯水润湿，将清洗干净的玻碳电极在麂皮上“8”字形打磨50次，然后轻微的转动方向继续“8”字形打磨，需多次转动方向打磨，玻碳电极打磨光滑后，用ddH2O、无水乙醇冲洗，然后连接三电极体系（工作电极：玻碳电极；参比电极：Ag/AgCl电极；对电极：铂片电极），对玻碳电极在电解液（5.0 mmol/L的K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]和0.1mol/LKCl的磷酸盐缓冲液，使用前N2除10min）中进行循环伏安法（CV）表征，扫描电位：-0.3V～0.8V，扫描速率：100mV/s，直至出现清晰的氧化还原峰，产生的氧化还原峰电位差小于100 mV，该电极才能达到试验标准，才能进行下一步试验，否则需要重复打磨电极[7]。

1.3.2 MIP-AuNPs-GCE的制备

将打磨好的玻碳电极浸泡在密封的0.5 g/L的氯金酸水溶液中（18.3MΩ·cm超纯水配制），连接好电极，在-0.2V的恒电位下连续地扫描200 s，使被还原的AuNPs沉积在电极表面，无水乙醇、ddH2O依次冲洗干净，然后在新配制的Piranha溶液中浸泡5min，再用ddH2O仔细冲洗，氮气吹干备用[8]。

将上述电极在1 mmol/L MUA乙醇溶液中反应12 h，用无水乙醇、ddH2O依次冲洗干净，然后在400mmol/LEDC和100mmol/LNHS混合液（1∶1，体积比）中，采用避光振荡的方式活化1 h，再将电极放入200mmol/LAIBA水溶液中反应3 h，反应完毕后，将制备的电极置入含有MAA（0.4 mmol）、EGDMA（0.8 mmol）、组胺（0.2mmol）、DMSO（5mL）的预聚合液中（置入电极前，先超声除氧10min），N2除氧10min后，迅速封闭容器，60℃反应16 h。待聚合反应完毕后，用甲醇∶冰乙酸=9∶1（体积比）混合液洗脱模板分子4次，每次40min，然后再用甲醇溶液洗脱模板分子2次，最后用无水乙醇、ddH2O冲洗干净，氮气吹干备用。不加模板分子，按同样方法制备NIP膜。MIPAuNPs-GCE传感器的构建图见图1。

图1 MIP-AuNPs-GCE传感器的构建图Fig.1 The construction diagram of the MIP-AuNPs-GCE electrochemical sensor

1.4 试验条件的优化

1.4.1 最佳pH值的筛选

本试验对传感器检测组胺的pH值进行了优化，具体方法如下：将1.0 ng/mL组胺溶液的pH值分别调到4～12，再将制备好的电极分别孵育10min，然后进行EIS法表征，每个水平检测3次，观察pH值对电阻抗变化（ΔZ＇）的影响。

1.4.2 孵育时间的优化

将制备好的电极在1.0 ng/mL组胺溶液中孵育，每隔1min进行EIS法表征，待电阻抗变化（ΔZ＇）不再随时间的变化而改变，说明电极对组胺分子的吸附已达到饱和，每个水平检测3次，记录数据进行分析。

1.5 电化学传感器的表征

应用Quanta 200FEG扫描电子显微镜（SEM）对电极表面的修饰物进行表征，然后对结果进行分析。

应用电化学阻抗谱法（EIS）对电极进行表征，试验首先确定组胺的检测范围，用制备好的电极分别检测不同浓度梯度的组胺标准液（0.25、0.5、1.0、5.0、10、50、100 ng/mL），每个浓度测量3次，根据试验数据绘制响应曲线及标准曲线，计算组胺的检测限值（LOD）。试验是在5.0mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]和0.1mol/L KCl的磷酸盐缓冲液中进行的，扫描电位：-0.3 V～0.8 V，扫描速率：100mV/s，检测时间约7min。

1.6 精密度试验

对1.0 ng/mL组胺溶液进行EIS表征，对同一电极洗脱和再生8次后进行重复检测，观察电阻抗变化，再取5支规格完全相同的电极按相同的方法制备MIP膜检测组胺溶液，评估该传感器的精密度，检验传感器的重复性、稳定性和再生性。

1.7 特异性分析

取10倍浓度的组胺结构类似物分别用修饰MIP膜、NIP膜的电极进行检测，评估MIP膜对组胺检测的特异性。

1.8 实样的制备及加标回收试验

为了对制备的传感器进行验证，以豆腐乳（购自本地超市）作为实样加标组胺进行检测，试验前先对样品前处理提取组胺，方法如下：取10 g样品加入含90mLPBS萃取瓶中，振荡20 s，静置5min，重复此操作2次，然后在4℃离心5min，过滤后制备得到原液，PBS稀释1 000倍，存放4℃备用。用提取液制备1.0、5.0、10 ng/mL的组胺溶液进行加标回收试验，根据试验数据计算加标回收率及相对标准偏差（RSD）。

1.9 数据的分析和处理

本试验用OriginPro8.0软件对所得数据进行了分析和处理。

2 结果与讨论

2.1 MIP-AuNPs-GCE的表征

将不同修饰状态下的玻碳电极用SEM表征见图2。

图2 不同修饰状态下的玻碳电极SEM表征图Fig.2 SEM images of the GCE with different modified states

从图2 A可以看出，电极上紧密排列的AuNPs清晰可见，结构均一；图2 B中可见大量的蜂窝结构，在AuNPs上制备MIP膜后，电极表面的结构发生变化，其形貌有着明显的差异。

2.2 AuNPs的信号放大作用及检测范围的确定

将相同试验条件下构建的MIP-AuNPs-GCE与MIP-Au分别对不同浓度组胺进行检测，检测结果如图3所示。

图3 不同修饰的电极检测不同浓度组胺的电阻抗变化图Fig.3 The sensor response of the different modified electrodes in different concentrations of histamine

MIP-Au检测范围更窄，灵敏度更低，AuNPs-MIP-GCE具有较明显的信号放大作用，此时组胺浓度在0.25 ng/mL～100 ng/mL呈线性关系，故将组胺的检测范围定为：0.25 ng/mL～100 ng/mL。

2.3 电极电化学行为的研究

分别应用CV法和EIS法对不同修饰状态下的电极进行表征如图4所示。

图4（a）在玻碳电极表面电化学沉积AuNPs后，电子转移明显加快，氧化还原峰明显增高，信号具有明显放大作用，在AuNPs-GCE上制备MIP膜后，洗脱模板分子前，MIP-AuNPs-GCE与NIP-AuNPs-GCE的CV曲线相似，氧化还原峰都很低平，在洗脱模板分子后，MIP-AuNPs-GCE的CV曲线再次出现明显的氧化还原峰，但其电流小于裸电极的电流，而NIP-AuNPs-GCE未见明显变化。原理在于洗脱模板分子组胺后，MIP-AuNPs-GCE暴露出大量的印迹孔穴，电解液能经过孔穴直接与部分AuNPs-GCE接触，致使电子转移的阻力减小，电流增大，可以再次出现明显的氧化还原峰，而NIP膜没有孔穴暴露。图4（b）应用EIS法对电极进行表征，EIS曲线前面的半圆直径表示电子转移的电极表面电阻，试验效果同CV法。

图4 玻碳电极在不同修饰状态下的电化学表征图Fig.4 Electrochemical characterization of the GCE with different modified states

2.4 试验条件的优化

2.4.1 最佳pH值的选择

pH值对MIP-AuNPs-GCE电化学传感器检测组胺的影响见图5。

图5 pH值对MIP-AuNPs-GCE电化学传感器检测组胺的影响Fig.5 The MIP-AuNPs-GCE sensor detected histamine in varying pH conditions

该电化学传感器的性能依赖检测环境的pH值，pH值的变化对传感器影响较大，直接影响传感器的电化学表征，检测组胺时必须对pH值进行优化。由于组胺在不同的pH值形态会发生较大的变化，将1.0 ng/mL组胺溶液的pH值分别调到4～12与MIP-AuNPs-GCE孵育，然后进行EIS法表征，当pH值在7～9之间时，电阻抗的变化明显大于其它pH值，而当pH值位于8时，该传感器达到最佳检测效果。

2.4.2 孵育时间的优化

本研究还对电极孵育时间进行了优化，设定孵育时间范围为：1min～15min，通过对组胺的检测研究孵育时间与电阻抗变化（ΔZ＇）的关系，检测结果如图6所示。

图6 孵育时间对MIP-AuNPs-GCE传感器响应信号的影响Fig.6 Effect of incubation time on the MIP-AuNPs-GCE sensor

孵育时间从开始的1min增加至10min时，电极的电阻抗变化（ΔZ＇）呈逐渐上升趋势，在孵育10min之后曲线变得平稳，未见明显波动，可认为在孵育10 min后电极对组胺的吸附达到饱和状态，故本试验将最佳孵育时间设定为10min。

2.5 吸附响应试验及标准曲线的建立

应用EIS法对不同浓度的组胺进行表征，如图7所示。

图7 EIS对不同浓度组胺的表征图Fig.7 EIS characterization of different concentrations of histamine

可见各个浓度组胺对应的EIS响应信号成梯度变化。根据EIS响应信号变化，通过OriginPro8.0软件绘制出剂量响应曲线和标准曲线，见图8。

绘制的剂量响应曲线是一个典型的等温结合反应曲线，该曲线的初始信号上升激烈，而后逐渐出现饱和平稳，将组胺浓度进行对数变换，绘制出标准曲线：Y=2.953 lg X+1.968，R2=0.998 8，根据三倍的信噪比（S/N=3）计算出检测限值：0.22 ng/mL。

图8 MIP-AuNPs-GCE电化学传感器检测组胺的响应曲线及标准曲线Fig.8 Response curve and calibration curve of the MIP-AuNPs-GCE sensor for histamine

2.6 精密度试验

应用制备的玻碳电极对组胺溶液进行电化学表征，选用1.0 ng/mL组胺的原因在于当组胺浓度为该值时，响应曲线的电阻抗变化位于曲线的陡直阶段，当组胺的浓度稍微发生变化，电阻抗的变化就会发生较显著的改变，要想得到较一致的响应信号，必然对传感器的灵敏度要求很高，因此选用1.0 ng/mL组胺进行精密度实验能够更好的反应出传感器的灵敏度。用同一电极重复检测组胺8次，电阻抗的变化（ΔZ'）一致性较好，相对标准偏差（RSD）为1.82%，应用制备条件完全相同的5根玻碳电极分别对该浓度组胺进行检测，电极电阻抗变化的RSD为4.21%，均表明构建的传感器稳定度好、精密度高。

2.7 特异性分析

分别用MIP膜、NIP膜修饰的玻碳电极检测不同浓度的组胺溶液，每个浓度检测3次，比较结果如图9所示。

图9 MIP膜与NIP膜对组胺检测的选择性比较Fig.9 Selectivity comparison of MIP film and NIP film for histamine

MIP膜对组胺的吸附作用要明显好于NIP膜，可以认为制备的MIP膜对组胺有良好的选择性。再应用制备的电极分别对组胺及10倍浓度的结构类似物进行检测，结果如图10所示。

图10 组胺与结构类似物的电阻抗变化的比较Fig.10 The impedance shift of histamine and structural analogues

均表明制备的MIP膜对组胺的特异性高、选择性好，而MIP膜和NIP膜对组胺结构类似物均无选择性。2.8实际样品应用

为了研究MIP-AuNPs-GCE电化学传感器的实用性，本研究选择组胺含量高的豆腐乳作为实际样品进行检测，在检测之前先对样品进行处理并提取组胺，对制备的提取液进行加标回收试验，每个浓度测量3次，该传感器的加标回收率在93.57%～103.93%之间，其相对标准偏差（RSD）位于0.93%～3.08%之间，详细结果见表1所示。

表1 以豆腐乳作为实际样品应用MIP-AuNPs-GCE电化学传感器检测组胺的加标回收试验（n=3）Table1 The content of histamine in fermented bean curd samples were detected by the senor using the spiked recoveries method（n=3）

3 结论

本研究首先将AuNPs电沉积在打磨好的玻碳电极表面，然后在电极表面的AuNPs上共价接枝引发剂，再聚合制备能够特异性识别组胺的MIP膜，洗脱模板分子组胺，制备得到大量的印迹孔穴，其功能结构与模板分子互补，能与组胺分子发生特异性结合，从而建立能够检测组胺的MIP-AuNPs-GCE电化学传感器。当MIP膜上的印迹孔穴特异性识别组胺分子后，该传感器的表征信号会发生变化，可以得到组胺浓度变化与电化学响应信号变化的关系。经过对MIPAuNPs-GCE电化学传感器的选择性、重复性、稳定性和再生性分析，试验结果表明该传感器对组胺结构类似物无明显的交叉反应，具有极好的重复使用性能和极好的稳定性。用豆腐乳进行实样检测和加标回收试验，检测效果好，具有很好的发展前景。

[1]Lehane L,Olley J.Histamine fish poisoning revisited[J].International Journal of Food Microbiology,2000,58:1-37

[2]Fernandez-Salguero J,Mackie I M.Technical note:Preliminary survey of the content of histamine and other higher amines in some samples of Spanish canned fish[J].International Journal of Food Science and Technology,1987,22:409-412

[3]Frank H A,Yoshinaga D H,Nip W K.Histamine formation and honeycombing during decomposition of skipjack(Katsuwonus pelamis)at elevated temperature[J].Marine Fishery Review,1981, 43:9-14

[4]Yoshitake T,Ichinose F,Yoshida H,et al.A sensitive and selective determination method of histamine by HPLC with intramolecular excimer-forming derivatization and fluorescence detection[J].Biomedical Chromatography,2003,17:509-516

[5]Keyzer J J,Wolthers B G,Muskiet F A,et al.Measurement of plasma histamine by stable isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry:Methodology and normal values[J].Analytical Biochemistry,1984,139:474-481

[6]Ujike A,Ishikawa Y,Ono M,et al.Modulation of Immunoglobulin (Ig)E-mediated Systemic Anaphylaxis by Low-Affinity Fc Receptors for IgG[J].The Journal of Experimental Medicine,1999,189(10): 1573-1579

[7]Cheng CN,Peng Y,Bai J L,et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes in milk by self-assembled electrochemical immunosensor. Sensors and Actuators B,2014,190:900-906

[8]Zhang X Y,Peng Y,Bai J L,et al.A novel electrochemical sensor based on electropolymerized molecularly imprinted polymer and gold nanomaterials amplification for estradiol detection[J].Sensors and Actuators B,2014,200:69-75

New-style Electrochemical Sensors for the Detection of Histamine

JIANG Sui-yi1，WU Ye-bin1，WANG Hao1，NING Bao-an2，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，GAO Zhi-xian2，*
（1.61251 Troops Medical Team of PLA，Qinhuangdao 066102，Hebei，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Institute of Health and Environmental Medicine，AMMS，Tianjin 300050，China）

By the optimization of the experimental conditions，a MIP-AuNPs-GCE electrochemical sensor was established which had a very good specificity，stability，and selectivity for histamine detection.The electrochemical behaviors of the electrode were studied and its change regulation was obtained.The signal amplification effect of AuNPs was also verified.Electrochemical measurements were performed via electrochemical impedance spectroscopy（EIS）and the calibration curve obtained.The calibration curve formula was Y=2.953 lg X+1.968（R2= 0.998 8）.The minimum detection limit of the established method was0.22 ng/mL.The sensing technique allows for the detection of histamine in the wide range from 0.25 ng/mL to 100 ng/mL and detection time less than 30 min.The content of histamine in fermented bean curd samples were also detected using the spiked recoveries method.The determination results indicated good recoveries，ranging from 93.57%to 103.93%，with relative standard deviation（RSD）of0.93%to3.08%.The detection results had a good statistical significance.

histamine；electrochemical sensing technology；molecularly imprinted polymer（MIP）films；AuNPs signal amplification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.024

2016-05-19

国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ140371）；国家自然科学基金青年项目（21207161）；天津市科技支撑计划（14ZCZDSF00021）

姜随意（1982—），男（汉），医师，硕士研究生，研究方向：营养与食品卫生学。

*通信作者：高志贤（1966—），男（汉），研究员，博士生导师，研究方向：营养与食品卫生学。