杨桃多糖提取工艺及其应用研究

宋照风

（佛山科学技术学院化学与化工系，广东佛山528000）

杨桃多糖提取工艺及其应用研究

宋照风

（佛山科学技术学院化学与化工系，广东佛山528000）

利用酸性热水浸提法提取杨桃多糖，通过研究影响杨桃多糖提取率的4个因素：料液比、温度、提取时间、提取次数进行单因素的研究。采用正交试验定了杨桃多糖最佳的提取工艺是：料液比为1∶4（体积比），浸提时间是3 h，提取温度是80℃，提取次数3次，各因素影响杨桃多糖提取率的次序是：温度＞料液比＞浸提时间＞提取次数。杨桃多糖的最佳的纯化工艺是：用无水乙醇沉淀多糖（多糖液与乙醇的体积比是1∶5），活性炭脱色，Savage法脱蛋白。最后用透析袋进行透析得到灰白色粉末状的杨桃多糖。杨桃多糖对羟基自由基的清除率随着杨桃多糖的浓度增大而增大。清除羟基自由基的能力最高可达51.49%。当杨桃多糖的浓度达到一定时，多糖对羟基自由基的清除率受杨桃多糖的影响不大。

杨桃多糖；提取；纯化；自由基

杨桃，被子植物门，是一种产于热带亚热带的水果，具有较高的营养价值[1]。杨桃性喜高温潮湿，宜在疏松肥沃的壤土栽培[2]。杨桃营养丰富且全面，果实内含有糖类（包括淀粉、葡萄糖、果胶、果糖、戊聚糖、甘露醇、其它膳食纤维等）、维生素、蛋白质、多种氨基酸、脂肪等成分。作为杨桃中最主要的活性物质多糖和果胶的含量比较高，而活性多糖是不可多得的药用物质，具有降血糖、降血脂、抗衰老和抗癌症等功能性作用[3]。据中国疾病预防控制中心营养和食品安全所《中国食物成分表》记载，每100 g鲜杨桃中营养成分组成为：水分92.5g，碳水化合物5.3g，蛋白质0.6g，果，1.5g，脂，1.2 g，膳食纤维1.1 g，维生素C 4 mg，维生素A 2.53mg，钾元素126mg，磷元素27mg，镁元素6mg[4]。

杨桃能减少机体对脂肪的吸收，有降低血脂、胆固醇的作用，对高血压、动脉硬化等心血管疾病有预防作用[5]。近年来，随着人民的生活水平的提高，他们的保健意识越来越强，开始逐渐改变以前的饮食方式，而越来越重视食物的营养和功能性结构[7]。目前的杨桃开发应用仅仅限于低层次的加工和应用，对于杨桃中的活性物质的开发应用还没有得到很充分的利用和体现。

多糖是由单糖连接而成的天然大分子聚合物，广泛存在于自然界中[8]。近几年来对杨桃多糖的研究逐步引起广大专家的重视。杨桃多糖作为杨桃中主要的活性物质，它的功能性在很早以前就已经被人们知道，但是由于技术的缺乏导致人们并不知道发挥这种功效的主要物质是杨桃多糖。不过随着技术的不断发展，人们对于杨桃的研究不断的深入才对杨桃多糖的提取方法、性质以及功能性作用有了很深入的了解。

杨桃多糖是杨桃中最主要的活性成分之一。杨桃中的多糖是以糖蛋白的形式存在的，主要由糖（69.82%）、蛋白质（17.53%）、氨基酸组成，其中糖的部分是由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸等组成。杨桃多糖为灰白色粉末，溶于水，易溶于热水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，但会溶于低浓度的乙醇、乙酸乙酯等一些有机溶剂。杨桃多糖溶于水后，其溶液为透明粘稠状[9]。

随着对杨桃多糖研究的深入，人们逐渐认识到杨桃多糖及其复合物分子具有十分重要的生物功能[10]，杨桃多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系。

近年来，不少人已经开始研究杨桃多糖的提取纯化方法、多糖的生物活性机制及其活性功能等等。目前的研究热点是优化杨桃多糖的提取方法，确定其最佳提取工艺条件、杨桃多糖的生物活性机制及应用、研究杨桃多糖活性与结构的关系并加以有效的改造，使之增强原有的活性等[11]。随着对杨桃多糖研究的深入，利用杨桃多糖来开发的保健食品的市场前景被人们看好。

国内在对多糖的提取做了大量的研究[12]，但是杨桃多糖的提取纯化工艺的研究很少，针对这一现状，本文改进了提取纯化的工艺条件，已获取制备杨桃多糖的最佳工艺。

1 材料与仪器

1.1 材料

萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、丙酮、蒽酮、聚乙二醇、三氯甲烷、异戊醇、石油醚、活性炭、过氧化氢、正丁醇、氯仿等：以上试剂均购于广州化学试剂厂，纯度为分析纯。

1.2 仪器

FA2004电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；KA-1000低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；721可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵：巩义市英裕予华仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1 测定杨桃多糖浓度标准曲线

用分光光度法[13]测定杨桃多糖的浓度，其原理是：多糖类成分在浓硫酸作用下，先水解成单糖，然后迅速脱水成糖醛衍生物，最后与苯酚缩合成有色化合物，该产物在490 nm处有强吸收峰。

标准曲线的绘制：准确称取葡萄糖10.0mg，定容至200mL的容量瓶中，配制成质量浓度为50μg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分别于6支试管中，加入蒸馏水至2.0mL，滴入5滴苯酚溶液，摇匀后迅速加入5.0mL浓硫酸，摇匀后静置10min，然后沸水水浴加热15min，迅速冷却至室温，以蒸馏水作为空白溶液，在490 nm处用721可见分光光度计测定其吸光度。以葡萄糖的质量浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标作标准曲线，用最小二乘法作线性回归[14]，得到葡萄糖质量浓度（C）与吸光度（A）的曲线。

杨桃多糖提取率的计算公式：

杨桃多糖的提取率/%=（多糖的质量浓度×多糖溶液体积×稀释倍数×10-6）/样品质量×100

2.2 提取工艺参数的确定

根据前人的研究，杨桃多糖提取的方法有热水浸提法、碱提取法、酸提取法、水煮乙醇沉淀法、超声波辅助提取法[15]、复合酶提取法等。根据现有的条件以及经验基础，选用酸提取法提取杨桃多糖，主要从料液比、提取时间、浸提温度、提取次数这4个因素来考虑对提取率的影响。

2.2.1 料液比对提取率的影响

准确称取5mL杨桃汁4份，分别加入15、20、25、30 mL蒸馏水，置于80℃的水浴中，浸提2 h，提取1次，离心，滤液稀释后用苯酚-硫酸法[16]测定杨桃多糖的浓度，计算提取率。

2.2.2 时间对提取率的影响

准确称取5mL杨桃汁4份，加入20mL蒸馏水，控制水温80℃，分别浸提1、2、3、4 h，提取1次，离心，滤液稀释后用苯酚-硫酸法测定杨桃多糖的浓度，计算提取率。

2.2.3 温度对提取率的影响

准确称取5mL杨桃汁4份，加入20mL蒸馏水，置于温度不同的恒温槽中，控制水温分别是60、70、80、90℃，浸提2 h，提取1次，离心，滤液稀释后用苯酚-硫酸法测定杨桃多糖的浓度，计算提取率。

2.2.4 提取次数对提取率的影响

准确称取5mL杨桃汁4份，加入20mL蒸馏水，提取次数分别为1、2、3、4，置于80℃的水浴中，浸提2 h，离心，滤液稀释后用苯酚-硫酸法测定杨桃多糖的浓度，计算提取率。

2.3 杨桃多糖的纯化工艺与试验方法

杨桃粗多糖液→沉淀多糖→脱色→除蛋白→透析→二次沉淀→洗涤→烘干→杨桃多糖

2.3.1 多糖沉淀

提取得到的杨桃多糖液要进行沉淀，一般都是用乙醇作为沉淀剂，不过也有文献表明丙酮也可以作为杨桃多糖的沉淀剂，本试验主要是研究无水乙醇和丙酮这两种沉淀剂对杨桃多糖的沉淀量得影响[17]。

2.3.2 脱色

多糖提取物脱色采用活性炭法和双氧水法[18]。活性炭法是将醇沉淀的多糖用一定量的蒸馏水溶解，加入一定量的活性炭，水浴加热搅拌一定时间，趁热抽滤。滤液用无水乙醇沉析，抽滤，真空干燥得杨桃精多糖。

双氧水的脱色法是将醇沉淀的多糖用一定量的蒸馏水溶解，按杨桃多糖浓缩液与过氧化氢的体积比为4∶1加入30%的过氧化氢溶液，磁力搅拌2 h脱色，去除色素。最后用无水乙醇沉析，抽滤，真空干燥得杨桃精多糖。

2.3.3 脱蛋白

杨桃粗多糖中含有游离蛋白，会影响多糖的分离提纯。因此，在提纯前需将游离蛋白除去。目前去除游离蛋白的有效方法是Savage法[19]。在杨桃粗多糖中加入氯仿-正丁醇混合溶液进行充分振荡，将游离蛋白变性成为不溶性物质，经离心分离去除，反复进行5次～8次才能很好地去除蛋白质。

在已脱色的杨桃多糖液中加入多糖液体积1/4的氯仿—正丁醇（一定比例的混合液），搅拌振动30min，置于分液漏斗中，静置，分液，去上层清夜。在波长为595 nm处用可见分光光度计测溶液的吸光度，用去离子水做空白溶液。重复上述试验过程，直到吸光度值基本不变。本试验主要研究氯仿与正丁醇的比例对脱蛋白效果的影响，研究体积比比例为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。

2.3.4 透析

透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。用透析法可以除去多糖中的无机盐、单糖、多糖等杂质，从而达到分离的效果。

将已经脱蛋白后的多糖液装入透析袋内，将透析袋放入装有蒸馏水的大烧杯中，透析2 d，乙醇沉淀，抽滤，真空干燥。

2.4 杨桃多糖的含量测定

准确称取5mL杨桃汁，按照所确定的最佳工艺条件提取杨桃多糖，稀释至100mL的容量瓶中，用移液管量取2.0mL的多糖液，按葡萄糖标准曲线[13]的制作方法进行测定，按照下面公式计算多糖含量：

杨桃多糖含量/%=（C×W×f）/M×100

式中：C为葡萄糖的浓度，g/mL；W为多糖液的稀释因素；f为换算因子；M为杨桃多糖的质量，mg。

换算因子f的测定方法：

准确称取0.020 g杨桃多糖，加水溶解，定溶于100mL的容量瓶中，用移液管量取2.0mL多糖液，按葡萄糖标准曲线的制作方法测其吸光度值。按照下式计算换算因子[14]：

式中：m为多糖质量，g；C为葡萄糖的浓度，g/mL；W为多糖的稀释因素。

2.5 杨桃多糖清除自由基

H2O2与Fe2+混合后发生Fenton反应而生成活性较强的羟基自由基，再与水杨酸生成有色物质，该产物在510 nm处有强吸收峰，若体系中加入清除羟基自由基的物质，则会减少有色物质生成，吸收度降低，吸收度越低，清除羟基自由基的能力越强[20]。

取6支试管，依次编号，每支试管中各加入9mmoL/L硫酸亚铁1mL，9mmoL/L水杨酸—乙醇溶液2 mL，按照试管的编号加入不同浓度的杨桃多糖2 mL，最后加入8.8mmoL/L过氧化氢2mL，在室温下反应1 h。以蒸馏水代替杨桃多糖液作为空白溶液调零，在510 nm处测定样品的吸光度。

清除率的计算公式如下：

式中：A0=0.437，为空白对照液的吸光度；As为样品的吸光度。

3 结果与分析

3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线的数据见表1。

表1 标准曲线的数据Table1 Data of the standard curve

用分光光度法在490 nm下测定其吸光度，绘制葡萄糖的标准曲线，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

经统计直线回归处理，得回归方程为：A=0.023 5C-0.010 6，线性相关系数R=0.997 55，式中：A为吸光度；C为葡萄糖浓度（μg/mL）。

3.2 杨桃多糖提取率影响因素分析

3.2.1 料液比对提取率的影响

料液比对提取率的影响见图2。

图2 料液比对杨桃多糖提取率的影响Fig.2 Solid-liquid ratio impact on the rate of carambola polysaccharide

本试验所谓的料液比是1mL杨桃汁与蒸馏水的体积之比。由图2可知，随着料液比的增大，杨桃粗多糖的提取率液减少。到了1∶4到1∶5之间，提取率增大，其最高点在1∶5。所以，可得出杨桃多糖最佳的料液比是1∶5。

3.2.2 时间对提取率的影响

时间对提取率的影响见图3。

图3 时间对杨桃汁多糖提取率的影响Fig.3 Time on carambola juice extraction rate of polysaccharides

由图3可知，提取时间越长，杨桃多糖的提取率越随之增大，而且在1 h～3 h间，随着时间的增加，3 h后，提取率下降。综上所述，杨桃的提取时间最佳为3 h。

3.2.3 温度对提取率的影响

温度对提取率的影响见图4。

图4 温度对杨桃多糖提取率的影响Fig.4 Carambola influence of temperature on the extraction rate of polysaccharides

由图4可知，随着温度的升高，杨桃多糖的提取率也大致随之增大，但随之又下降，无法确定其最佳温度。但从提取率来说，其最适宜的温度是80℃。

3.2.4 提取次数对提取率的影响

提取次数对提取率的影响见图5。

图5 提取次数对杨桃多糖提取率的影响Fig.5 Extraction times influence on the rate of carambola polysaccharide

由图5可知，在相同条件下，提取次数越大，提取率随之减小。但3次之后，提取率减小，可能原因是提取过程中，杨桃多糖的流失。所以，最佳的提取次数是3次。

3.3 正交试验的结果分析

3.3.1 正交试验的设计

单因素试验结果，正交试验因素和水平设计如表2。

表2 杨桃多糖提取的水平因素表Table2 Level factor of pumpkin polysaccharide extracttables

3.3.2 正交试验结果及分析如表3所示。

表3 正交试验结果分析表Table3 Results analysis table orthogonal experiment

由表3可知，根据k值可得最佳因素水平组合为A1B3C2D3，即提取杨桃多糖的最佳工艺条件是料液体积比1∶4，浸提时间4 h，提取温度80℃，提取次数为4次。但是考虑到提取的成本和效率，实际最佳提取工艺调整为料液体积比为1∶4，浸提时间3 h，提取温度80℃，提取次数为3次。经验证试验，实际最佳工艺条件下所得提取率为49.7%，可验证实际最佳工艺合理。

3.4 沉淀剂和脱色剂对杨桃多糖纯化的影响

3.4.1 沉淀剂的影响

用无水乙醇作为沉淀剂，得到的杨桃多糖是黄褐色固体，其沉淀量为2.342 g（5mL杨桃汁）；采用95%乙醇作为沉淀剂，得到的杨桃多糖也是呈黄褐色，但沉淀量却大大减少，其沉淀量只有2.126 g（5mL杨桃汁）；采用丙酮作为沉淀剂，得到的杨桃多糖也是呈黄褐色，但沉淀量却大大减少，其沉淀量只有1.828 g（5mL杨桃汁）。所以，相对来说，无水乙醇更适合作为杨桃多糖的沉淀剂。

3.4.2 脱色剂的影响

经活性炭脱色的杨桃多糖呈灰白色、粉末状；用过氧化氢脱色的杨桃多糖呈乳白色，是颗粒较小的粉末。就产品外观来说，过氧化氢的脱色效果比较好。但是过氧化氢脱色损耗较大，使最终得到的杨桃多糖大大减少，可能原因是过氧化氢具有强氧化性，容易导致杨桃多糖结构的破坏，使杨桃多糖得率减少。而活性炭法条件温和，不会影响到杨桃多糖的得率，故采用活性炭法脱色较好。经过半透膜透析后，沉淀干燥后得到灰白色杨桃多糖粉末。

另外还需要考虑用氯仿和正丁醇对脱蛋白的影响。脱蛋白反复次数就越多，消耗的氯仿、正丁醇也就越多，而且也会损耗一定的杨桃多糖溶液。氯仿—正丁醇的比例为4∶1和5∶1时脱蛋白的次数一样，但5∶1消耗的氯仿较多，而且氯仿是有毒试剂。综上所述，氯仿、正丁醇的比例为4∶1为最佳比例详见表4。

表4 氯仿-正丁醇比例影响脱蛋白次数表Table4 Chloroform-butanol ratio on the number of tables deproteinized

最后，通过测定计算得出杨桃多糖的含量是41.23%，比纯化之前的多糖含量偏低。主要原因是纯化过程中有一定的杨桃多糖损失，造成多糖含量偏低，未纯化之前粗多糖中的杂质也是影响杨桃多糖含量的测定。

3.5 杨桃多糖抗氧化性的初步研究分析

多糖对羟基自由基的清除率计算结果见表5。

由图6可知，随着杨桃多糖的浓度增大，多糖对羟基自由基的清除率也越来越大，而且当杨桃多糖的浓度达到一定时，多糖对羟基自由基的清除率受杨桃多糖的影响不大。本试验测定杨桃多糖对羟基自由基的清除率最高可达51.49%。

表5 多糖对羟基自由基的清除率Table5 Polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate

图6 清除率随浓度变化曲线图Fig.6 Clearance rate of change with concentration curves

4 结论和讨论

1）经过单因素和试验确定了杨桃多糖最佳的提取工艺是：料液比为1∶4（体积比），加热时间是3 h，提取次数3次，其最适宜的温度是80℃。

2）随着杨桃多糖的浓度增大，多糖对羟基自由基的清除率也越来越大，也即是抗氧化性也越来越强，而且当杨桃多糖的浓度达到一定时，多糖对羟基自由基的清除率受杨桃多糖的影响不大。清除羟基自由基的能力最高可达51.49%。

3）因试验设备的限制，对于杨桃多糖的干燥，只能进行简单的真空干燥，可能干燥得不够彻底，对提取率有一定的影响。

[1]朱银玲.杨桃多糖的提取及免疫活性研究[D].广州:广东工业大学工学硕士学位,2008

[2]毛波.从杨桃中制取多糖、果脯和杨桃粉的工艺研究[D].武汉:湖北工业大学,2012

[3]朱银玲,谭竹钧,李伟才,等.杨桃多糖的提取研究[J].食品工业科技,2008,29(3):105-107

[4]ZHEM ERICHKIN D A,PTITCHK N A N M.The composition and properties of pumpkin and sugar beet pectins[J].Food Hydrocolloids, 1995,9(2):147-149

[5]陈文燕,林燕如.超声波辅助提取杨桃叶多糖的工艺研究[J].现代食品科技,2013,29(5):1100-1102

[6]吕群金,衣杰荣,丁勇.微波法提取杨桃渣中多酚的工艺研究[J].安徽农业科学,2009,37(15):7187-7189

[7]罗旭艳,黄建春,杨欣,等.杨桃根多糖体外抗氧化作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(4):111-113

[8]肖湘,薛日海,张小芬.杨桃提取物体外清除氧自由基作用[J].天然产物研究与开发,2012(7):963-965,968

[9]朱银玲,谭竹钧.杨桃中多糖成分的纯化与鉴定[J].Modern Foodence&Technolog,2008(2):161-163

[10]熊冰,高梦祥.超声辅助浸提南瓜多糖的工艺研究[J].农产品加工,2007(1):64-67

[11]向东,金鑫,赖凤英.南瓜多糖的分离与纯化[J].食品与发酵工业, 2004,30(8):130-133

[12]陈玉玲,张宜英,王碧.南瓜多糖的提取及纯化[J].内江师范学院学报,2010,25(2):38-41

[13]Sumathi Balasubramaniam,Heng Chin Lee,Hamid Lazan,et al.Purification and properties of ab-galactosidase from carambola fruit with significant activity towards cell wall polysaccharides[J].Phytochemistry,2005,(66):153-163

[14]魏丕伟,王凌云,熊俐,等.枳棋多糖提取工艺研究[J].江苏农业科技,2012,40(8):272-274

[15]王振强,申森,樊欣.甘草多糖提取纯化工艺研究[J].食品研究与开发,2012,33(5):41-44

[16]石国荣,饶力群.微波萃取技术在天然产物活性成分提取中的研究进展[J].化学与生物工程,2003(6):4-6

[17]樊君,尚红伟,王华敏．大枣多糖的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2002,23(3):29-31

[18]倪德江,谢笔钧,宋春和．乌龙茶多糖提取条件的优化[J]．食品科学,2002,23(12):35-39

[19]王莉,鲁建江,顾承志．微波技术在板蓝根多糖提取及含量测定中的应用[J]．中药材,2001,24(3):180

[20]张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社, 1987:6-7

Extracted Technology and Applied Research of Carambola Polysaccharide

SONG Zhao-feng
（Department of Chemistry and Chemical Engineering，Foshan University，Foshan 528000 Guangdong，China）

This study was the use of hot water extraction of acidic polysaccharides carambola，starfruit four factors polysaccharide extraction rate by studying effects：liquid ratio，temperature，extraction time，extraction times to study single factor. By orthogonal set of carambola best extraction of polysaccharides were：Solid-liquid ratio of 1 ∶ 4，extraction time was 3 hours，extraction temperature was 80 ℃，extracting 3 times，the factors affecting the rate of the order of carambola polysaccharide are：temperature＞ liquid ratio＞ extraction time＞ extraction times. Best carambola polysaccharide purification process were：anhydrous ethanol precipitated polysaccharide（multiple sugar and ethanol volume ratio was 1 ∶ 5），active carbon，Savage Law deproteinized. Finally，dialysis bag and dialyzed to obtain a white powder carambola polysaccharide. Carambola polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate increased as the concentration increases carambola polysaccharides. Ability to scavenge hydroxyl radicals was up to 51.49 %. When the concentration reached a certain carambola polysaccharide，the polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate was not affected carambola polysaccharides.

carambola polysaccharides；extraction；purification；radicals

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.013

2016-03-09

宋照风（1984—），女（汉），实验师，硕士研究生，研究方向：天然产物提取。