江苏省河蟹主养区河蟹微孢子虫感染率调查与研究

孙梦玲 ，黄桦 ，刘洪岩 ，赵彦华 ，薛晖

河蟹，学名中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国的名贵水产品之一。江苏省养殖规模达400余万亩，养殖产量高达30余万吨，产值超过两百亿元，河蟹产量不足江苏省渔业产量的10%，而产值却占江苏省渔业产值的将近50%，同时江苏省的河蟹产量占据了国内河蟹总产量的一半以上[1]。然而，伴随着河蟹养殖产业的迅猛发展，大闸蟹的病害暴发也相继出现。2015年，江苏省内多处大闸蟹养殖主产区相继发生严重病害，患病的蟹表现为肝胰腺坏死、逐渐发白水化，附肢空瘪无力，病死率达40%以上，造成严重经济损失[2]。养殖户称此病为“水瘪子”病，经过丁正峰[3]研究发现，河蟹微孢子虫（Hepatospora eriocheir）与河蟹“水瘪子”病的发生存在密切关联，并将“水瘪子”病命名为河蟹肝胰腺坏死症。微孢子虫是一种有着广泛寄主的真核单细胞生物，可以感染多种经济动物，如家蚕等。水生生物同样是微孢子虫的一大类寄主，微孢子虫可感染智利王蟹（Lithodes santolla）、堪察加拟石蟹（Paralithodes camtschaticus）、扁足拟石蟹（Paralithodes platypus）、蓝蟹（Callinectes sapidus）、首长黄道蟹（Cancer magister）等，微孢子虫感染中华绒螯蟹由王文等[4]人首次报道。

赵彦华[5]通过对2015年7月至2016年1月的主养区发病河蟹进行感染率调查，刘洪岩[6]对2016年4—11月的河蟹主养区发病河蟹感染率进行调查，结果发现肝胰腺坏死症的发生率与微孢子虫的感染率成正相关[5]。刘洪岩通过使用蜗牛消化酶提取河蟹微孢子虫基因组确认可以提高检测灵敏性[6]，因此在相关前期研究的基础上，我们在江苏省内河蟹主养区进一步开展微孢子虫感染率的调查及研究。

1 材料与方法

1.1 样本采集及处理

本次调查共选取武进、宜兴、高淳、兴化、金坛、常熟、宝应及扬中为病害监测点及样品采集点，各测报点定期汇报最新病情，同时实地走访发病塘口，了解发病历史，发病季节及发病症状。在每个采集点随机选取养殖户4～10户进行样品采集，采样时间为2017年2月至2017年7月，在河蟹一壳、二壳及三壳的蜕壳时期进行跟踪采集，分别为2月底至3月初、5月初及7月底至8月初，依据各地养殖面积，选取养殖户6～10户，每批次每个养殖户塘口随机选取河蟹10只，将活体置于保温箱内带回实验室。在实验室内，取活体河蟹肝胰腺组织约100 mg置于75%酒精，为后期PCR检测做准备，剩余肝胰腺收集于eppendorf管内并编号后置于-80℃冰箱储存。

1.2 材料

Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒购于上海生工生物有限公司，β-巯基乙醇购于Sigma，PCR反应Mix购于南京唯赞生物科技，100 bp DNA ladder购于南京唯赞生物科技，PCR仪为Biometra T-Gradient Thermoblock，电泳仪及凝胶成像仪为BIORAD，恒温金属浴为Bioer CHB-202，冷冻离心机为Eppendorf 5417R。

1.3 检测方法

1.3.1 河蟹微孢子虫基因组提取 河蟹微孢子虫基因组的提取，在刘洪岩证实蜗牛酶消化液法可提高河蟹微孢子虫检出率的基础上，采用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒进行抽提，操作方法参照说明书。

1.3.2 PCR 检测方法采用丁正峰建立的传统PCR法，PCR上游引物为：Q2F 5'-AGGGTGTTAGATTTGTTCGCA-3'，下游引物为：Q2R 5'-CCGCATTCATGGATCTCTTACA-3'。检测反应体系为：Q2F（10 mM）1uL，Q2R（10 mM）1 μL，样本 DNA 1 μL，PCR mix 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，总反应体积为25 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性 1 min，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，进行35个循环；72℃充分延伸10 min，后4℃保存待检测。

1.3.3 琼脂糖凝胶 取PCR反应产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶含量为1%（提前加入核酸染料 Gold View），电压120 V，电泳时间为35 min，电泳结束后将凝胶置于紫外灯下观察PCR扩增结果。

2 结果

2.1 流行病学调查

“水瘪子”病引起河蟹大规模死亡于2015年在兴化市首次被报道，在台风过境以后，发生了大规模死亡，并且一直持续到2016年底，连续两年兴化均为重灾区，发病率达80%以上，病死率同样高达40%以上。2016年“水瘪子”引起的死亡从苏北兴化地区扩散至南京高淳，再至苏南的武进、宜兴甚至苏州阳澄湖地区，2016年在苏南地区由“水瘪子”引起的河蟹病死率在20%～30%，宜兴地区个别乡镇高于30%，阳澄湖地区也有水瘪子典型症状死蟹发生，但病死率在5%以下，感染率不超过15%。2017年的“水瘪子”病发生率较往年又有极大幅度的下降，在流行病学调查过程中，仅7月份高温时期有常州武进区一例发病上报，其余测报点均未有发生“水瘪子”病典型症状死亡的病例上报。

在武进地区发生的高温后河蟹死亡病例，与由“水瘪子”病引起的死亡症状相同，病蟹肝胰腺发白甚至水化，附肢空瘪无力，河蟹进笼后无法逃离，发病时期也与典型“水瘪子”蟹吻合，在夏季高温后引起突发性批量死亡。

2.2 河蟹微孢子虫感染率

通过跟踪采样发现，各地区微孢子虫感染率不高，第一批样品中仅武进及金坛地区发现有微孢子虫感染，且感染率均低于5%（表1），在河蟹第二次蜕壳后，在兴化、金坛及扬中地区的样品中发现有微孢子虫感染，感染率分别为2.7%、2.4%及3.5%（表2），在河蟹三壳以后，在武进地区有一家养殖户在7月高温期间发生河蟹死亡，发病症状为典型的河蟹肝胰腺坏死症，从该养殖户处采回样品为100%阳性，在同批采样的8家养殖户中为唯一一家有阳性率检出的塘口，本次采样阳性率为16%，同时常熟地区及宝应地区在三壳以后首次有河蟹微孢子虫检出，阳性率为4.6%及2.7%（表3），经过持续采样，宜兴及高淳两地的河蟹，通过普通PCR方法未检出有河蟹微孢子虫感染。

表1 河蟹一壳后微孢子虫感染率

表2 河蟹二壳后微孢子虫感染率

表3 河蟹三壳后微孢子虫感染率

3 讨论

通过持续的流行病学调查及实验室感染率检测发现，2015年及2016年为“水瘪子”病发生率及病死率较高的两年，经过赵彦华及刘洪岩的实验室检测同样发现河蟹微孢子虫的感染率在发病率高的养殖区域长期持高水平状态，本次为期8个月的采样，覆盖了河蟹的大半个生长周期，同样得到比较一致的检测结果，即“水瘪子”发病率与河蟹微孢子虫带毒率高度相关，表现出一致性，因此持续的流行病学调查间接证明了河蟹微孢子虫为引起河蟹“水瘪子”病的病原。因此，笔者建议可将河蟹微孢子虫的感染率作为河蟹“水瘪子”发病的监控指标，在未来的生产实践中，对其进行定期检测，掌握其分布及感染情况，为“水瘪子”病的防控提供参考，防止再次发生大规模暴发性死亡。在本次采样调查中，发现武进地区唯一一例“水瘪子”病典型发病案例，发生在7月长期高温以后，与2015年兴化首次发生河蟹“水瘪子”病大规模死亡发生在台风过境且后期持续高温一样，都是在极端天气以后引起了被感染河蟹的死亡。因此，在实际生产中，要留意极端天气的来临，尤其在台风、长期降雨及长时间高温等天气来临前，要做好预防措施，可以提前补充免疫增强剂，增强抗应激能力，针对肝脏损伤，可以服用保肝护肝药物，调节肝脏功能，提高河蟹机体免疫力及抗病能力[7]。

武进地区发现的高温后发病的个例，在第一次跟踪采样时，检出结果为100%阴性，但高温后发生死亡，并且检出强阳性，对于可能的原因，笔者认为：普通PCR检测河蟹微孢子虫的限度在10的3次方的水平；低于该数量级，则难以通过普通PCR测得。经过荧光定量PCR检测发现，首次采样带回的肉眼观察健康且有活力的河蟹，体内河蟹微孢子虫含量在10的2次方以下，因此笔者认为，在正常生长状态下的河蟹，池塘养殖蟹及长江野生蟹也可能感染有少量河蟹微孢子虫，极端天气造成河蟹应激反应，免疫力下降，导致体内病原复制迅速提高，从而致病。

在通过此次流行病学调查及带毒检测的基础上，笔者认为，后期需要进一步搞清楚的问题有：河蟹微孢子虫的感染方式是垂直传播还是受环境中微孢子虫感染，在此基础上才能进行最根本的防治，加强亲本蟹及苗种蟹的检验检疫，建立SPF蟹的养殖，从而降低河蟹的微孢子虫感染率。

[1]朱凛，韩飞，朱成德.江苏省河蟹产业发展的历史回顾[J].水产养殖，2012，33（9）：23-24.

[2]吴加平，张凤翔，韩玲.河蟹“水瘪子”现象的思考与防治对策[J].科学养鱼，2016（6）:14-16.

[3]Z Ding，Q Meng，H Liu，et al.First case of hepatopancreatic necrosis disease in pond-reared Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis，associated with microsporidian[J].Journal of Fish Diseases，2016，11（15）:1-9.

[4]W Wang，J Chen.Ultrastructural study on a novel microsporidian，Endoreticulatus eriocheir sp.nov.（Microsporidia，Encephalitozoonidae），parasite of Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis（Crustacea，Decapoda）[J].Journal of Invertebrate Pathology，2007，94（2）：77.

[5]赵彦华，刘洪岩，丁正峰，等.江苏省河蟹主养区微孢子感染情况调查报告[J].水产养殖，2017，38（01）:11-14.

[6]刘洪岩，赵彦华，孙梦玲，等.蜗牛消化酶提取河蟹微孢子虫基因组反应条件的优化[J].水产养殖，2017（04）:35-39.

[7]周日东，王松刚，张凤翔.河蟹水瘪子病的发生与应急措施[J].科学养鱼，2016（4）:92-92.