柿炭疽病研究进展

王 洁，余贤美，艾呈祥

柿树(Diospyros kaki Thunb.)原产于我国，是双子叶植物纲(Magnoliopsida)柿目(Ebenales)柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物。柿果、柿蒂和柿霜等包含丰富的营养物质，具有重要的药疗保健效用［1，2］。柿树炭疽病是柿树生产上的毁灭性灾害，主要危害柿果实和嫩枝，造成果实腐烂，枝条枯死导致树体整株死亡，还能危害贮藏期柿果实，该病害分布于国内主要柿树栽培区，已严重制约了我国柿树产业的可持续发展［3～6］。炭疽菌是一类重要的植物病原真菌，具有丰富的形态学及遗传多样性。因此，明确柿树炭疽病病原菌种类、炭疽菌的侵染过程，对保证果树稳产增产具有重要意义。

1 柿炭疽病病原菌

1.1 柿炭疽菌的种类与命名

柿炭疽病病原最初被鉴定为柿盘长孢菌(Gloeosporium kaki Hori)［7～9］。1921 年，Maffei［10］将在意大利帕维亚植物园柿叶部分离鉴定的病原菌鉴定为Colletotrichum.kaki，与G.Kaki Hori相比生物学特性略有差异。随后，Von Arx［11］在系统研究炭疽菌的分类时，认为柿盘长孢菌(G.kaki Hori)和C.kaki是一样的，他们与胶胞炭疽菌C.gloeosporioides均为同物异名，将柿树炭疽病菌正式统一为柿盘长孢菌(G.kaki Hori)，并在一段时间内得到普遍应用［3］。但是，同时期胶胞炭疽菌也作为柿炭疽病病原菌被频繁应用［5］。

炭疽菌具有丰富的形态学及遗传多样性，单纯的形态学无法准确的对其进行分类鉴定［12，13］。随着分子生物学的发展，多基因进化树分析结合形态学方法已逐渐成为炭疽菌分类鉴定的可靠工具，得到了世界范围内的认可［14～16］。Weir等［15］研究了来自中国、日本和新西兰的标本，形态学结合真菌转录间隔区(rDNA-ITS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)基因的系统发育分析，将柿树炭疽病菌的表位型重新界定为柿盘长孢菌G.Kaki Hori，而分类学上将其归类为一类新的炭疽菌，命名为柿树炭疽菌C.horii，成为C.Gloeosporioides sensu lato复合种的成员之一。我国浙江无核柿树炭疽菌也被重新鉴定为柿炭疽菌(C.horii)［17］。自此，柿树炭疽病病原菌被正式命名为柿炭疽菌(C.horii)。

1.2 柿炭疽菌生理分化

国内外研究表明，不同的炭疽菌可以侵染同种植物［16，18］。例如，我国苹果炭疽病病原菌可分为7个分类单元，包括已知种6个，新种1个［18］。虽然柿炭疽病的病原菌种类未见系统研究的报道，但是从世界各地的报道中不难发现柿炭疽病病原菌同样存在多样性。Kim等［19］室内试验证明，辣椒上分离的C.acutatum能侵染柿树。Williamson等［20］发现，美国柿果实炭疽病菌是由C.acutatum引起的。此后，在韩国也发现C.acutatum侵染果实能引起柿果的黑斑病［21］。通过对我国5个省的柿主产区进行调查笔者发现，C.horii为我国柿炭疽病的主要病原菌，同时新发现喀斯特炭疽菌(C.karstii)也能引起柿叶片和枝条的炭疽病，喀斯特炭疽菌C.karstii比C.horii更易侵染叶片，且引起的症状也更明显［22］。Palou等［23］发现，C.gloeosporioides能引起贮藏期柿果实病害。由此可见，柿炭疽病病原菌存在多样性，进行大范围的调查及鉴定，明确不同地区柿炭疽病病原菌种类及其侵染规律，对于柿炭疽病的防治具有重要意义。

2 炭疽菌致病机理研究

2.1 侵染策略

炭疽菌属真菌在不同寄主植物和同种寄主不同组织器官上主要存在2种不同的侵染策略:细胞内半活体营养型(intracellular hemibiotrophy)和角质层下内部死体营养型(subcuticular intramural necrotrophy)［24］。

研究表明，C.horii属于细胞内半活体营养型。半活体营养型炭疽菌侵染过程中，孢子在寄主表面迅速萌发，形成短芽管，然后分化形成成熟的黑褐色附着胞。这些附着胞产生较高的膨压和再分化形成侵染钉，通过向植物细胞释放水解酶穿透寄主表面的角质层［24，25］。在柿炭疽菌(C.horii)附着胞形成过程中，核相发生2次有丝分裂变化。第一次有丝分裂发生在分生孢子固着聚苯乙烯塑料培养皿3～4 h后，随后，分生孢子中部形成一个隔膜，把它分成2个细胞;6～7 h后，分生孢子发生第二次有丝分裂。分裂后，一个核通过芽管移入附着胞中。通过对不同柿品种及同一个柿品种的不同部位进行接种，观察致病性、附着胞形成和侵染特性，发现柿树炭疽菌在不同柿树表面均能形成附着胞，附着胞多产生在寄主表皮背斜细胞壁间结合处(JACWs)或近结合处。而侵染菌丝的形成和扩展方式可能是其寄主专化性(或致病性)差异的重要机制之一［5］。

凹陷的寄主原生质膜围绕侵染泡囊和初生菌丝，界面之间形成界面基质，这些基质把真菌细胞壁和凹陷的寄主原生质膜分开。超微结构研究表明，机械力和酶降解作用，是柿炭疽菌(C.horii)初生菌丝和次生菌丝产生穿透性以破坏叶柄寄主细胞的主要作用力，在其侵染柿叶柄过程中有2个阶段，即初生菌丝的活体营养阶段和次生菌丝的死体营养阶段。初生菌丝与具有沉积物的寄主原生质膜之间有一层界面基质(interfacial matrix)，初生菌丝扩张并侵染相邻细胞时，围绕着初生菌丝层的界面基质消失，具有沉积物的原生质膜被逐步降解，细胞开始死亡，产生次生菌丝，在死的细胞中繁殖和扩展，并产生分枝直接穿透较薄的寄主细胞壁，无缢缩或任何变形现象，菌丝顶端部分未见隔膜产生;在穿透较厚的细胞壁时，靠近顶端处产生隔膜，顶端细胞膨大，使寄主细胞壁撕裂［25，26］。研究还发现，炭疽菌与柿树互作的界面上，寄主原生质膜具有明显的波浪形皱缩［27］，这明显不同于模式菌株菜豆炭疽菌与寄主互作界面上光滑的寄主原生质膜，表明柿炭疽菌(C.horii)与植物的互作可能是一种新的体系。

与细胞内半活体营养型不同，角质层下内部死体营养型炭疽菌整个侵染过程检测不到活体营养阶段。豇豆与C.capsici的互作就是属于这个类型。分生孢子萌发形成附着胞后，病原菌穿透角质层，并在其下生长形成菌丝网，侵染早期阶段进入细胞腔，在菌丝迅速扩展前，提前杀死宿主细胞。菌丝侵入寄主植物表皮细胞和叶肉细胞，引起更多细胞的死亡［28］。

2.2 致病相关基因克隆

病原菌与寄主互作是个极其复杂的过程，其间必定涉及了大量的基因参予不同阶段的表达调控。在炭疽菌属真菌中已经鉴定并克隆了多个与致病相关基因，例如影响致病性的果胶酸盐裂解酶(PL)基因，介导附着胞形成的转录因子CLSTE12，在病菌侵染的初级阶段起作用的cgdn3基因，影响致病性的2个功能不同果胶裂解酶基因pnl-1和pnl-2，以及二酰基甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyl transferase)和角质酶CglCUT1等基因［29～34］。菜豆炭疽菌转录激活因子clta1基因可能调控菜豆炭疽菌从活体营养向死体营养生长转化的作用。李明江［35］利用同源扩增及TAIL-PCR在柿炭疽菌中扩增出了与cgta1同源的基因，证明了柿炭疽菌从活体体营养向死体营养的转换机制。孙虎［36］构建了柿炭疽菌基因组文库，并筛选了致病性突变体，克隆了3个无致病性突变体的侧翼序列，证明它们分别与24-C甲基转移酶、核糖体蛋白和真核翻译起始因子3个致病性相关基因具有较高同源性。王伟［37］推测哈锐炭疽菌的fstf(Fungal specific transcriptional factor)基因可能和活体营养相关，构建并转化了该基因的敲除载体，为研究其功能奠定了基础。通过转录组学研究，发现柿炭疽菌(C.horii)比同属的C.higginsianum和C.graminicola含有更多的系谱专化性基因［38］。综上所述，柿炭疽菌(C.horii)可能存在较为专化的致病基因。

3 柿炭疽病的防治

通过十字交叉法和血球计数板法测定柿树炭疽病菌菌丝生长，结果表明，最适温度为20～30℃，最适产孢温度为25～30℃，最适生长的pH值为5～6［39，40］。目前，柿炭疽病的防治还是以化学防治为主。利用菌丝生长速率法和包子萌发法分别测定16种常用杀菌剂的作用，结果表明，质量浓度为33.5 g/L的喹啉铜悬浮剂，25 g/L的溴菌腈乳油和70 g/L的代森锰锌可湿性粉剂对柿炭疽菌的抑菌效果最好，可作为优选药剂［40］。田间试验结果显示，质量浓度为25g/L的咪鲜胺乳油600倍液的防治效果可达到89.60%［41］。针对不同菌株及不同地区的化学防治药剂还需进一步研究。

4 展 望

中国柿品种资源丰富，种内变异复杂，柿树炭疽病作为一种毁灭性病害，对柿树产业的发展造成了严重威胁。目前柿炭疽病研究还停留在传统的病原鉴定上［5，41，42］，未见系统性研究柿炭疽病的报道。我国柿炭疽病的病原种类还未明确，抗病品种筛选研究相对较少［43］;同时，关于柿炭疽菌(C.horii)的致病机理研究相对滞后。为了更加合理的预防控制该病害，急需明确我国不同柿产区柿炭疽菌种类及其发病规律，制定有针对性的防治策略;同时加大筛选抗病品种的力度，为抗病育种奠定基础;进一步开展柿炭疽病致病机理，为更深入的了解柿炭疽菌与植物互作提供理论基础。

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