单磷酸腺苷活化蛋白激酶调控细胞自噬的机制研究进展

桂迪，黄晓颖，王良兴

（1．温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；2．温州医科大学附属第一医院 呼吸内科，浙江 温州 325015）

・综 述・

单磷酸腺苷活化蛋白激酶调控细胞自噬的机制研究进展

桂迪1，黄晓颖2，王良兴2

（1．温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；2．温州医科大学附属第一医院 呼吸内科，浙江 温州 325015）

自噬是细胞对外界环境应激所作出的反应，是细胞降解自身成分以维持细胞活性和生存的过程。在动物组织中，自噬机制的缺陷通常和细胞衰老、年龄相关性退化性疾病有关联，这些疾病包括心血管疾病、癌症、免疫系统功能受损和神经系统病变等。目前已经发现，许多蛋白可以对能量、营养和生长因子水平以及应激做出反应，其中包括一些激酶，它们可以正向或负向调节自噬过程以调节细胞对外界环境的适应性。最近研究表明细胞可以通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）对上述适应反应发挥重要作用，本文就近些年有关AMPK对自噬调控机制的研究成果作一综述。

单磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；ULK1；自噬；综述文献

自噬是细胞通过溶酶体途径来降解自身成分的过程[1]，胞内待降解的蛋白复合物、受损的细胞器以及入侵的病原体等被自噬囊泡包裹并运送到溶酶体，进而被降解以维持细胞的自我稳态[2]。YORIMITSU等[3]研究发现，在哺乳动物细胞中共存在3种形式的自噬，分别是大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。而这3种不同的自噬途径最终都通过溶酶体体系对细胞内成分进行蛋白水解。同时，自噬也是一个紧密调控的过程，自噬缺陷和很多人类疾病相关，包括肿瘤、心肌病和神经系统退行性疾病等[5-7]。自噬在所有细胞中均处于较低的水平，有利于维持细胞的平衡状态[4]。早期对自噬相关基因及其机制的研究大都来自酵母菌基因实验[8]，随后也对高等真核生物进行了研究，并命名了相应的真核生物自噬相关基因[9-10]。大量研究提示单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）可以通过不同的通路调节哺乳动物的自噬过程[11-14]，因此，进一步阐明其对自噬调控的作用，有可能为自噬相关性疾病的治疗提供新思路。

1 自噬的起始调控元件

在自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）中，ATG1在自噬的起始调控中发挥着关键性的作用，它可以和ATG13、ATG17形成复合物，然而雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin，TOR）对ATG13的磷酸化调控可以抑制其与ATG1的结合进而阻断上述复合物的形成[19-23]。哺乳动物中有与ATG1类似的同类物，包括ULK1和ULK2[24-25]，不同的是ULK1与ATG13则始终联系在一起的，并且ULK1才是哺乳动物自噬起始的关键调控单元[14]。

2 AMPK的结构

AMPK是一种异源三聚体蛋白的丝/苏氨酸蛋白激酶，其包括1个催化亚单位α与2个调节亚单位β和γ[15-16]，其中α亚单位又分为α1和α2亚型，β亚单位包括β1和β2亚型，γ亚单位包括γ1、γ2和γ3亚型。α亚单位在N端含有丝/苏氨酸的结构域，是其主要的催化部位，而C端则为与另外2个亚单位的结合位点[17]。激活的AMPK可以刺激产能的分解代谢途径并抑制耗能的合成代谢过程，进而在能量代谢平衡的调节上起到关键性的作用[15-16]。

3 AMPK对自噬信号的调节

目前的研究提示AMPK可以对自噬的起始进行调控，在AMPK对ULK1的调控机制中，不同的研究有着不同的观点，包括作用位点的不同以及其对ULK1是正向抑制或是负向的调控作用。同时，AMPK除了可以通过ULK1对自噬产生调控外，也可以通过哺乳动物TOR（mTOR）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制物P27对自噬产生调控作用，其中对mTOR的调控可以间接通过磷酸化ULK1相应位点而起到对自噬的调节作用，以下将对各条通路机制进行总结。

3.1 AMPK通过直接作用于自噬相关蛋白ULK1参与自噬的调节 AMPK可以直接作用于自噬起始调控单元，在KIM等[12]的研究中，他们以细胞为实验对象研究AMPK在ULK1的磷酸化位点，通过对ULK1的不同位点进行点突变的方法，共检测了ULK1的苏氨酸（Threonine，Thr）624、丝氨酸（Serine，Ser）494、Ser555、Ser574、Ser622、Ser693、Ser811、Ser317和Ser777共9个位点，最终发现在ULK1丝/苏氨酸富集区的Ser317和Ser777 2个位点是AMPK对其主要的磷酸化位点。若同时突变这2个位点，可以明显减少离体状态下AMPK对ULK1的磷酸化，而突变其余的7个磷酸化位点则ULK1的磷酸化不受影响。更进一步，当细胞处于饥饿状态时，AMPK可以通过直接磷酸化ULK1进而促进自噬的发生，而AMPK的抑制剂compoud C则可以抑制此状态下细胞的ULK1位点的磷酸化。同时，在对AMPKα1和α2双基因敲除的细胞检测中也发现，与未敲除基因的细胞相比，前者ULK1的Ser317和Ser777位点磷酸化明显减少。

与前者的磷酸化位点不同的是，在EGAN等[11]的研究中，通过检索真核生物蛋白数据库发现ULK1为AMPK的磷酸化作用蛋白之一，其中共筛选出4个可以和AMPK匹配的作用位点，分别是Ser467、Ser555、Ser637、Thr574。进一步的实验研究表明，在细胞水平，AMPK可以通过以上4个位点直接磷酸化ULK1。通过质谱分析研究发现在体情况下AMPK仅通过Ser555、Ser637以及Thr574 3个位点直接作用于UKL1。

除了磷酸化位点的不同，也有研究表明AMPK对ULK1的作用可能不仅仅是简单的激活作用。SHANG等[14]研究指出，应用细胞培养条件下稳定同位素标记技术（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）标记细胞后，在饥饿的细胞中，ULK1的Ser638、Ser758位点的磷酸化减少了10倍以上。进一步深入研究发现Ser638位点同时受AMPK和mTOR的调控，前者为去磷酸化作用，而后者为磷酸化作用，Ser758位点则单由mTOR的磷酸化作用调控。然而AMPK亚单元（AMPKα和AMPKγ1）可在营养充足的状态下与ULK1相结合，与AMPK结合后，ULK1启动自噬作用就会明显减弱，此外mTOR对ULK1的Ser758位点的磷酸化作用可进一步加强AMPK与ULK1的结合，进而抑制自噬作用的发生。因而可能AMPK在自噬调控中存在着双重作用，当细胞处于饥饿状态时，AMPK可以促进自噬的发生，但当细胞在营养状态丰富的情况下，AMPK则可以抑制细胞自噬的发生。

3.2 AMPK通过作用于mTOR参与自噬的调节 TOR是能量（包括氨基酸、ATP等）和激素的感受器[29]，在细胞生长调控中起着非常重要的作用，同时也是自噬过程的重要门控基因。在哺乳动物细胞中，核糖体蛋白S6（ribosomal protein S6，p70S6）可发挥强烈的自噬抑制作用，而mTOR激酶则可调节其活性大小[30]。同时，mTOR可以通过其他多条通路对自噬产生抑制作用:①转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）是溶酶体生成的主要调控者，而mTOR复合物1（mTOR complex 1，mTORC1）可以通过负性调控TFEB使溶酶体的生成减少，进而损伤自噬的进程[31]；②mTORC2可以通过丝/苏氨酸蛋白激酶B（AKT）通路来下调AMPK，从而激活mTORC1-S6[32]，另外，在饥饿状态的骨骼肌细胞中，阻断mTORC2可以诱导细胞的自噬[33-34]；③mTOR可以直接磷酸化ULK1的Ser757位点，使AMPK磷酸化ULK1减少[12]，同时使AMPK与ULK1相结合，抑制自噬的发生[14]；④在对酵母的研究中发现，自噬过程的产生需要ATG13与ATG1的结合，然而TOR通路可以磷酸化ATG13，使其与ATG1的亲和力明显减低，进而抑制自噬[21]。

然而，AMPK可以通过2条通路对mTOR进行调控，从而促进自噬的发生。INOKI等[28]研究发现，当细胞处于饥饿状态下时，激活的AMPK可以直接磷酸化结节性硬化症相关蛋白2（tuberous sclerosis proteins 2，TSC2）的Thr1277和Ser1345位点，进而抑制mTOR的活性。通过RNA干扰技术敲低细胞的TSC2蛋白的表达，则可以消除由于能量不足而被诱导的S6K的去磷酸化。

GWINN等[26]研究发现，在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中，AMPK激活剂AICAR和苯乙双胍可以通过TSC2快速地抑制mTORC1的活性，然而即使是在TSC 2-/-的MEFs中，mTORC1的活性仍然可以被上述2种药物有效地抑制，这提示存在AMPK的其他下游通路可以直接或者间接的调节mTORC1的活性。随后进一步实验提示，AMPK可以直接磷酸化mTOR调控相关蛋白（regulatoryassociated protein of mTOR，raptor）的Ser722和Ser792 2个Ser位点，从而抑制mTORC1的活性。当把这2个Ser位点进行基因沉默后，发现两者均可以防止AMPK激动剂对mTORC1的活性抑制作用。同时NOJIMA等[27]的研究表明，raptor可以与真核细胞始动因子（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1）、核糖体S6蛋白激酶（ribosomal protein S6 kinase 1，P70S6K1）在其各自的保守TOR信号（conserved TOR signaling，TOS）区域结合进而激活mTORC1的活性，使信号通路下传。上述研究结果提示，AMPK对raptor的磷酸化调控可能影响了raptor的此作用途径，进而导致mTORC1活性下降。

3.3 AMPK通过作用于细胞周期蛋白依赖激酶抑制物P27参与自噬的调节 在相关研究中，研究者以人乳腺癌细胞系（michigan cancer foundation-7，MCF-7）为研究对象，发现AMPK激动剂AICAR可以通过肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）-AMPK通路磷酸化P27 Thr198位点进而提高其稳定性，以诱导自噬产生，使细胞在生长因素缺乏及代谢压力下通过自噬而得以存活[18]。P27在自噬和细胞生存中所起的作用可能依赖于其阻止细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶的作用。

4 小结

AMPK最初被认为在细胞的代谢中起着关键性的作用，随着研究的不断进展，发现AMPK的作用远不止于此，目前发现其在自噬方面也起着重要的作用，AMPK可以通过作用于ULK1的不同的丝/苏氨酸位点使其发生磷酸化进而促进自噬的发生，同时在营养充足的状态下其可以结合ULK1而抑制自噬的发生。另外，AMPK可以通过直接影响mTOR及细胞周期蛋白依赖激酶抑制物P27进而调控自噬。但目前在ULK1丝/苏氨酸区域的作用位点方面，发现不同研究中存在着明显差异，进一步阐明差异的原因，如由于细胞类型、处理方式、刺激时间和强度的不同而致使其作用位点的不同，或是同一细胞中各个位点均有涉及，只是其中一个位点占主导地位等，可以为自噬缺陷相关疾病的防治提供依据、手段以及新的思路，值得我们进一步研究。

[1] YANG Z, KLIONSKY D J. Eaten alive: a history of macroautophagy[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12(9): 814-822.

[2] 韩笑, 李丹, 林成仁, 等. 自噬研究新进展[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(10): 1267-1269.

[3] YORIMITSU T, KLIONSKY D J. Autophagy: molecular machinery for self-eating[J]. Cell Death Differ, 2005, 12 (Suppl 2): 1542-1552.

[4] SALMINEN A, KAARNIRANTA K, KAUPPINEN A. Inf ammaging: disturbed interplay between autophagy and inf ammasomes[J]. Aging, 2012, 4(3): 166-175.

[5] HUANG J, KLIONSKY D J. Autophagy and human disease [J]. Cell Cycle, 2007, 6(15): 1837-1849.

[6] LIANG C, JUNG J U. Autophagy genes as tumor suppressors[J]. Curr Opin Cell Biol, 2010, 22(2): 226-233.

[7] SARKAR S, RUBINSZTEIN D C. Huntington’s disease: degradation of mutant huntingtin by autophagy[J]. FEBS J, 2008, 275(17): 4263-4270.

[8] TSUKADA M, OHSUMI Y. Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae [J]. FEBS Lett, 1993, 333(1-2): 169-174.

[9] NAKATOGAWA H, SUZUKI K, KAMADA Y, et al. Dynamics and diversity in autophagy mechanisms: lessons from yeast[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(7): 458-467.

[10] YANG Z, KLIONSKY D J. Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation[J]. Curr Opin Cell Biol, 2010, 22(2): 124-131.

[11] EGAN D F, SHACKELFORD D B, MIHAYLOVA M M, et al. Phosphorylation of ULK1 (hATG1) by AMP-activated protein kinase connects energy sensing to mitophagy[J]. Science, 2011, 331 (6016): 456-461.

[12] KIM J, KUNDU M, VIOLLET B, et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1 [J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(2): 132-141.

[13] LEE J W, PARK S, TAKAHASHI Y, et al. The association of AMPK with ULK1 regulates autophagy[J]. PLoS One, 2010, 5(11): e15394.

[14] SHANG L B, CHEN S, DU F H, et al. Nutrient starvation elicits an acute autophagic response mediated by Ulk1 dephosphorylation and its subsequent dissociation from AMPK [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(12): 4788-4793.

[15] LAGE R, DIEGUEZ C, VIDAL-PUIG A, et al. AMPK: a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis [J]. Trends Mol Med, 2008, 14(12): 539-549.

[16] TIAN R, MUSI N, D’AGOSTINO J, et al. Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity inrat hearts with pressure-overload hypertrophy[J]. Circulation, 2001, 104(14): 1664-1669.

[17] POLEKHINA G, FEIL A, GPUTA A, et al. Crystallization of the glycogen-binding domain of the AMP-activated protein kinase β subunit and preliminary X-ray analysis[J]. Acta Crystallogr Sect Struct Biol Cryst Commun, 2005, 61(Pt 1): 39-42.

[18] LIANG J Y, SHAO S H, XU Z X, et al. The energy sensing LKB1-AMPK pathway regulates p27kip1 phosphorylation mediating the decision to enter autophagy or apoptosis[J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(2): 218-224.

[19] MIZUSHIMA N. The role of the Atg1/ULK1 complex in autophagy regulation[J]. Curr Opin Cell Biol, 2010, 22(2): 132-139.

[20] CHAN E Y, TOOZE S A. Evolution of Atg1 function and regulation[J]. Autophagy, 2009, 5(6): 758-765.

[21] KAMADA Y, FUNAKOSHI T, SHINTANI T, et al. Tor-mediated induction of autophagy via an Apg1 protein kinase complex[J]. J Cell Biol, 2000, 150(6): 1507-1513.

[22] KABEYA Y, KAMADA Y, BABA M, et al. Atg17 functions in cooperation with Atg1 and Atg13 in yeast autophagy[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(5): 2544-2553.

[23] CHANG Y Y, NEUFELD T P. An Atg1/Atg13 complex with multiple roles in TOR-mediated autophagy regulation[J]. Mol Biol Cell, 2009, 20(7): 2004-2014.

[24] CHAN E Y, KIR S, TOOZE S A. siRNA screening of the kinome identifies ULK1 as a multidomain modulator of autophagy[J]. J Biol Chem, 2007, 282(35): 25464-25474.

[25] YOUNG A R J, CHAN E Y, HU X W, et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes[J]. J Cell Sci, 2006, 119(18): 3888-3900.

[26] GWINN D M, SHACKELFORD D B, EGAN D F, et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint[J]. Mol Cell, 2008, 30(2): 214-226.

[27] NOJIMA H, TOKUNAGA C, EGUCHI S, et al. The mammalian target of rapamycin (mTOR) partner, raptor, binds the mTOR substrates p70 S6 kinase and 4E-BP1 through their TOR signaling (TOS) motif[J]. J Biol Chem, 2003, 278 (18): 15461-15464.

[28] INOKI K, ZHU T, GUAN K L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival[J]. Cell, 2003, 115(5): 577-590.

[29] DENNIS P B, JAESCHKE A, SAITOH M, et al. Mammalian TOR: a homeostatic ATP sensor[J]. Science, 2001, 294 (5544): 1102-1105.

[30] BLOMMAART E F, LUIKEN J J, BLOMMAART P J, et al. Phosphorylation of ribosomal protein S6 is inhibitory for autophagy in isolated rat hepatocytes[J]. J Biol Chem, 1995, 270(5): 2320-2326.

[31] CETRULLO S, D’ADAMO S, TANTINI B, et al. mTOR, AMPK, and Sirt1: key players in metabolic stress management[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2015, 25(1): 59-75.

[32] GONCHAROV D A, KUDRYASHOVA T V, ZIAI H, et al. Mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2) coordinates pulmonary artery smooth muscle cell metabolism, proliferation, and survival in pulmonary arterial hypertension[J]. Circulation, 2014, 129(8): 864-874.

[33] MAMMUCARI C, MILAN G, ROMANELLO V, et al. FoxO3 controls autophagy in skeletal muscle in vivo[J]. Cell Metab, 2007, 6(6): 458-471.

[34] ZHAO J, BRAULT J J, SCHILD A, et al. FoxO3 coordinately activates protein degradation by the autophagic/lysosomal and proteasomal pathways in atrophying muscle cells[J]. Cell Metab, 2007, 6(6): 472-483.

（本文编辑：赵翠翠）

R445.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.016

2016-02-26

国家自然科学基金资助项目（81473406）；浙江省卫生厅平台计划研究重点资助项目（2012ZDA033）。

桂迪（1985-），男，浙江慈溪人，硕士生。

黄晓颖，主任医师，副教授，Email:zjwzhxy@126. com。