食品微生物本科毕业论文实验的探索与实践——以干酪乳杆菌异源表达胆盐水解酶为例

熊智强 ， 张 汇， 艾连中

(上海理工大学医疗器械与食品学院 上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

大学的首要任务是培养高素质人才，本科毕业论文作为大学人才培养方案中重要的教学实践环节，具有其他教学环节所不能替代的实践性和综合性作用[1]。本科毕业论文是检验本科生综合运用所学专业知识和专业基本技能，考察学生分析和解决实际问题能力的一种重要手段[2-3]。通过完成毕业论文，让学生能够综合运用所学知识，独立地分析和解决问题，提升其综合素质，为其顺利进入社会奠定基础。毕业论文的质量，既是评定学生学业能力的一个重要指标，又是认定本科毕业和学士学位资格的一项重要依据[3]。然而，近些年随着大学严重扩招和就业形势日益严峻，大学本科毕业论文整体水平呈现逐步下滑趋势[3]。因此，提高本科毕业论文水平对提升大学生综合素质具有显著的意义。由于食品微生物是一门与农业和加工业联系紧密的学科，其毕业论文一般是在通过一系列实验获得实验数据的基础上，完成数据分析、论文撰写和最终通过论文答辩[4]。上海理工大学医疗器械与食品学院对本科毕业论文教学过程中，以“上海食品微生物工程研究中心”为载体，一直以功能性乳酸菌的筛选及其分子生物学为重要研究方向，对本科生毕业论文指导工作进行探索和实践。本文以“干酪乳杆菌异源表达胆盐水解酶”毕业论文为例，将有关的试验步骤和指导经验进行介绍，以期为食品微生物学科本科生毕业论文的指导工作提供参考。

1 论文选题

本科毕业论文安排在本科最后一个学期进行，但经常与毕业生就业、考研和公务员面试等关键节点相冲突[5]。为避免对学生就业的冲击和教师指导过于集中，食品微生物方向的指导教师会将毕业论文启动工作提前至第六学期末，使指导的学生从大三学期结束的假期开始有较长的时间来完成选题、查阅文献、实验设计和实施等毕业论文工作。毕业论文质量好坏关键在选题[6]，尤其是论文创新性。根据指导教师承担的科研项目和学生的科研兴趣，结合上海食品微生物工程研究中心的研究方向及实验条件，选定“干酪乳杆菌异源表达胆盐水解酶”为论文题目。

干酪乳杆菌是一种具有调节人体肠道菌群、促进消化吸收和增强人体免疫力等多种保健功能的重要益生乳酸菌[7]，广泛应用在发酵乳等食品工业生产中。例如，干酪乳杆菌LC2W是天然发酵食品中筛选的具有降血压功能的益生乳酸菌[8-9]，该菌株已经获得中国和欧洲发明专利授权，并已在光明乳业股份有限公司产业化应用，用于生产酸奶等发酵乳产品[8-13]。对干酪乳杆菌基因组分析发现[13]，基因组中并不存在胆盐水解酶基因(负责水解结合胆盐形成游离胆汁酸和氨基酸，使游离胆汁酸与胆固醇形成复合物沉淀，从而减少胆固醇含量)，造成其对胆盐的耐受性不强。因此，在干酪乳杆菌中异源表达植物乳杆菌来源的胆盐水解酶，可显著提高干酪乳杆菌的胆盐耐受性，对开发降低胆固醇的干酪乳杆菌产品提供参考。

2 实验准备

在实验准备阶段，指导教师应对学生进行理论知识、实验操作和仪器使用等方面集中指导，使学生在实验过程中尽可能减少不必要的错误。实验准备包括方案设计、试验材料和试剂准备等方面。指导教师将整个课题的前期工作和论文目标对学生进行介绍，让学生结合毕业论文实验内容进行文献查阅，了解研究背景和最新国内外研究进展，掌握干酪乳杆菌分子生物学和胆盐水解酶蛋白表达的研究情况，同时学习食品微生物厌氧培养和乳酸菌分子生物学基本实验操作。学生结合上述已掌握的相关知识，设计可行性的实验方案，并与指导教师进行方案讨论，最终确定实验方案和撰写开题报告。学生根据自己的实验设计，在指导教师协助下采购或采集实验所需的试剂、耗材或实验所需样本。

3 实验研究

实验研究是毕业论文的核心阶段[1-2，6]。在此阶段要培养学生的动手能力和科研思维能力，使学生能够具备分析和解决科研问题的能力。在实验过程中，要求学生态度严谨，严格完成实验设计，仔细观察实验现象，详实记录实验结果，每周进行实验总结，向指导教师汇报实验进展。指导教师帮助学生对实验结果进行分析，确定实验是否达到预期设计，实验方案是否需要进行调整。为方便学生实验研究，上海食品微生物工程研究中心实行开放式管理，每天早8:30至晚10:00对学生开放，学生可以根据自己的时间预约仪器和安排实验。

3.1 产胆盐水解酶菌株的平板定性筛选

学生通过文献查阅不难发现，很多种乳酸菌都含有胆盐水解酶，但活性各异。由于文献中酶活定义各不相同，很难比较出活性较高的胆盐水解酶。为了克隆高活性的胆盐水解酶基因，实验方案采用平板筛选法[14-15]，从实验室现有的乳酸菌中筛选高胆盐降解活性的菌株，从中进行胆盐水解酶基因克隆。通过平板筛选法对实验室保藏的乳酸菌菌种库进行快速定性胆盐水解酶筛选，发现5株植物乳杆菌能在含有5 mmol/L甘氨胆酸钠盐的MRS固体培养基上生长，其中3株植物乳杆菌有白色沉淀圈，说明这3株菌产胆盐水解酶有较好的活性。特别是植物乳杆菌AR113的白色沉淀圈最大，说明其胆盐水解酶酶活最强。通过这样简单的平板筛选法，快速地筛选出高活性的胆盐水解酶，避免了盲目克隆和表达出乳酸菌中低活性胆盐水解酶，大大地降低了实验失败风险。

3.2 胆盐水解酶表达重组质粒的构建

学生在进行本部分实验前，首先经过指导教师的分子生物学实验操作系统培训，使学生较为熟练的掌握乳酸菌基因组DNA 提取、PCR技术克隆目的基因、PCR产物回收、酶切和连接、重组质粒的构建和验证等实验操作技能。所以，学生在进行植物乳杆菌基因组DNA提取和PCR克隆植物乳杆菌来源胆盐水解酶基因的实验过程较为顺利，经琼脂糖电泳跑胶，发现DNA条带单一。同时Nanodrop仪器检测也显示，DNA质量较高，可以满足后期试验需要。利用PCR清洁回收试剂盒回收克隆的胆盐水解酶DNA片段，通过酶切和连接等分子生物学实验操作，最终顺利构建出表达植物乳杆菌来源的胆盐水解酶重组乳酸菌质粒。

3.3 胆盐水解酶在干酪乳杆菌中表达

目前蛋白表达最常用的原核宿主是大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌，乳酸菌并不是表达蛋白的通用宿主，蛋白表达量不高。此外，蛋白表达选用诱导型启动子表达方式最为常见，蛋白表达量较高，但在乳酸菌中诱导型表达方式对蛋白表达效果不能确定。为避免在乳酸菌中可能出现表达目的蛋白含量太低的情况，在实验设计时就选用了强的组成型启动子来对胆盐水解酶进行蛋白表达。另外，通过增加胆盐水解酶的基因拷贝数，可进一步增加蛋白表达。将胆盐水解酶重组质粒导入干酪乳杆菌中，聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白检测，成功观察到目的蛋白的表达。通过高效液相色谱检测，重组的胆盐水解酶具有一定的降胆盐能力，能较好的降解甘氨类胆盐，其中降解甘氨脱氧胆酸最强，甘氨胆酸其次，甘氨鹅脱氧胆酸的降解能力较弱。通过上述实验充分表明，植物乳杆菌来源的胆盐水解酶在干酪乳杆菌中得到了活性蛋白表达。

4 实验准备

学生按上述实验方案将全部实验完成后，与指导教师一起确定论文撰写大纲。按照拟定的大纲和学院相关要求完成论文初稿撰写，并交由指导教师修改。指导教师对论文条理、数据分析、结果与讨论等部分对学生做出指导，修改后返回给学生继续修改，如此反复多次直至定稿。学院同行专家和老师对定稿的毕业论文给出评阅意见，将意见返还学生修改。指导教师对再修改的论文进行审阅，给学生对毕业论文答辩提供建设性意见，使学生顺利通过毕业论文答辩。

5 小 结

毕业论文作为本科人才培养过程中一个重要的环节，是全面考核学生综合素质的有效方式[6]。通过论文选题、实验方案设计和实验研究等环节对食品专业学生进行食品微生物毕业论文指导和训练，使学生在毕业阶段极大地提高了对科研工作的兴趣，锻炼了学生的动手能力、科研思维能力和团队协作精神。按照上述本科毕业论文指导模式，学生初步掌握如何解决科学问题的方法和步骤，如何检索和查阅相关文献，如何组织和实施实验，如何用软件处理实验数据和实验图片，如何分析实验结果和数据，如何撰写毕业论文等能力。

以“干酪乳杆菌异源表达胆盐水解酶”作为学生毕业论文题目，课题涉及到食品科学、微生物学、分子生物学等多个学科的理论与实验技能，要求学生在有限的时间内独立完成该毕业论文，这种自主性设计毕业论文能够较为全面地多层次考察学生的自我学习、分析问题、解决问题和动手能力。学生最终能够在有限的时间内高质量地完成实验，并顺利通过毕业论文答辩。毕业论文实验结果目前已被国外乳品顶级刊物Journal of Dairy Science接收，间接说明毕业论文题目选题恰当、立意新颖、具有较好的科学前沿性和创新性。学生实验构建异源表达植物乳杆菌来源胆盐水解酶的干酪乳杆菌工程菌，显著提高干酪乳杆菌的胆盐水解酶活性，具有潜在的应用价值和理论指导意义，为开发降低胆固醇的干酪乳杆菌发酵乳产品奠定基础。

[1] 马博. 生物技术专业本科毕业论文实验的探索与实践—以产油微生物的分离与鉴定为例[J]. 微生物学杂志, 2013, 33(4): 110-112.

[2] 程敏. 制药工程专业本科毕业论文探索与实践—以黄精多糖的提取、鉴别、含量测定为例[J]. 亚太传统医药, 2016, 12(12): 143-145.

[3] 吴仲, 李小艳, 徐伟. 食品科学与工程专业本科毕业设计的探索[J]. 大学教育, 2015，(4): 74-75.

[4] 李玉邯, 陈宇飞, 杨柳,等. 应用型地方本科院校食品科学与工程专业实践教学探讨[J]. 食品安全导刊, 2015，(30)：39.

[5] 游新勇, 汪磊, 王国泽,等. 食品科学与工程专业实验课程与毕业论文的改革与探讨[J]. 教育教学论坛, 2014，(1): 134-135.

[6] 修江帆, 赵文静, 张春林,等. 生物技术专业本科毕业论文设计性实验的初探—以环带库蚊ISSR-PCR反应体系建立及优化为例[J]. 贵州师范学院学报, 2014, 30(3): 82-84.

[7] Wang G, Yin S, An H, et al. Coexpression of bile salt hydrolase gene and catalase gene remarkably improves oxidative stress and bile salt resistance inLactobacilluscasei[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38(8): 985-990.[8] Ai L, Guo Q, Ding H, et al. Structure characterization of exopolysaccharides fromLactobacilluscaseiLC2W from skim milk[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 56: 134-143.

[9] 艾连中. 干酪乳杆菌LC2W胞外多糖制备、功能及结构的研究[D].无锡: 江南大学, 2007.

[10] Xu N, Liu J, Ai L, et al. Reconstruction and analysis of the genome-scale metabolic model ofLactobacilluscaseiLC2W[J]. Gene, 2015, 554(2): 140-147.

[11] Li N, Wang Y, Zhu P, et al. Improvement of exopolysaccharide production inLactobacilluscaseiLC2W by overexpression of NADH oxidase gene[J]. Microbiol Res, 2015, 171: 73-77.

[12] Li N, Huang Y, Liu Z, et al. Regulation of EPS production inLactobacilluscaseiLC2W through metabolic engineering[J]. Lett Appl Microbiol, 2015, 61(6): 555-561.

[13] Chen C, Ai L, Zhou F, et al.Complete genome sequence of the probiotic bacteriumLactobacilluscaseiLC2W[J]. J Bacteriol, 2011, 193(13): 3419-3420.

[14] Jayashree S, Pooja S, Pushpanathan M, et al. Identification and characterization of bile salt hydrolase genes from the genome ofLactobacillusfermentumMTCC 8711[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 174(2): 855-866.

[15] Dashkevicz MP, Feighner SD. Development of a differential medium for bile salt hydrolase-activeLactobacillusspp.[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(1): 11-16.