DNA甲基化在骨关节炎中的研究进展

谢庆云，魏 萌

(解放军成都军区总医院 a.骨科；b.肾脏(风湿)科，四川 成都 610083)

·综述·

DNA甲基化在骨关节炎中的研究进展

谢庆云a，魏 萌b

(解放军成都军区总医院 a.骨科；b.肾脏(风湿)科，四川 成都 610083)

骨关节炎是一种最常见的肌肉骨骼系统疾病，但病因学尚不清楚。DNA甲基化状态的改变可能参与了该病的病理生理学过程。现将对近期骨关节炎软骨的靶向DNA甲基化分析，全基因组甲基化研究以及表观遗传治疗在疾病中的应用予以综述。

骨关节炎；DNA甲基化；关节软骨；病因学

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性的肌肉骨骼系统疾病，可表现为不同程度的关节软骨丢失、骨质增生、软骨下骨改变和滑膜炎等， 后期将出现疼痛、关节畸形及功能障碍。OA是全球性主要的致残性疾病之一，70岁以上人群OA的发病率约为40%，估计全世界膝OA患者数量约为2.5亿[1]。OA主要的危险因素包括应力刺激、年龄、遗传、炎症、肥胖、损伤以及环境因素。到目前为止，OA的病因学尚不清楚，尤其是对发生影像学损害之前的早期分子生物学进程知之甚少。近几年，表观遗传学已经成为OA崭新且重要的研究领域。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，在OA发病中的重要作用相继被报道。本文将对DNA甲基化在骨关节炎中的研究进展做一综述。

1 表观遗传修饰

表观遗传修饰是指在没有发生DNA序列变化的情况下，基因表达和(或)表型所发生的可遗传的改变[2]。在机体发育和细胞分化的过程中，表观遗传修饰能对基因的表达产生整体、动态和稳定的影响，使得细胞单位在有丝分裂过程中得以维持，细胞通过这种方式来调控基因的表达从而适应环境的变化。因此，每种细胞或组织的表观遗传组都是其特有的，并且对饮食、锻炼和吸烟等内在或外在的环境因素产生时间和空间上的变化。

表观遗传修饰是通过调节基因的转录或者转录后环节来发挥作用，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA(ncRNAs)。在哺乳动物中，DNA甲基化一般发生在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)，主要表现为胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的现象。对于DNA甲基化功能的研究主要集中在基因的转录起始位点[3]。启动子区域的甲基化可以抑制基因的表达，一方面CpG位点甲基化直接干扰转录因子与调控区DNA结合，另一方面甲基化的DNA与甲基化CpG结合区蛋白如MeCP2特异结合形成复合物，限制了转录因子达到它们结合部位的通道，从而抑制基因表达[4]。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修饰的过程。基因的启动子、增强子、转录区域和沉默区域都有其自身独特的组蛋白标记物，对转录组产生不同的影响[5]。ncRNA是一类能转录但不编码蛋白质且具有特定功能的RNA分子，指各种不翻译成蛋白质的RNA分子，包括微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)等，通过影响转录、剪切或翻译来调节基因的表达[6]。

2 OA软骨的靶向DNA甲基化分析

目前OA的DNA甲基化研究主要聚焦于关节软骨，因为关节软骨是疾病进程中受累的核心组织，易于在人工关节置换手术中获取标本。此外，关节软骨是由软骨细胞单一类型细胞所构成，避免了多种细胞类型的组织会出现的遗传异质性。2005年Roach等[7]进行的一项研究纳入了晚期OA 16例和对照组10例，发现OA股骨头关节软骨的基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13以及ADAMTS4的表达增加，并且与这些基因启动子区域特定CpG位点的去甲基化相关。这是最早提出DNA甲基化在OA的发病机制中具有潜在作用的一项研究。此后，多项靶向DNA甲基化研究选取了从功能学上可能参与OA发病的基因，分别检测了软骨组织、原代软骨细胞和软骨细胞系中靶基因启动子的甲基化状态和mRNA表达水平。研究发现，OA的关节软骨或者分离出的软骨细胞中瘦素(leptin)、GDF5、NOS2、PHLPP1、SOST和IL-8基因的启动子或增强子特定部位的去甲基化与这些基因表达的增加相关[8-11]，而OA关节软骨中SOX9、SOD2和COL9A1启动子的甲基化水平增加会下调这些基因的表达[12]。

然而，这些研究结果还不足以证明软骨细胞DNA甲基化的改变参与了OA的发病机制，还需要进一步对这些关节软骨样本进行纵向研究，以发现甲基化的改变与基因表达、疾病表型之间的因果关系。尽管如此，甲基化的体外研究以及软骨细胞与去甲基化药物共培养的结果表明，DNA甲基化能够直接影响甲基化差异区域。此外，OA关节软骨MMP13、GDF5、SOX9和COL9A1的启动子区域，NOS2的增强子区域内特定CpG位点的DNA甲基化状态能够改变转录因子的结合，从而影响基因的转录[8-9，12-13]。

虽然这些研究提示了DNA甲基化异常在OA发病机制中的潜在作用，但这些靶向性分析具有一定的局限性。首先，并不是基因调节区域的每一个CpG位点都能够进行检测，因此不能直接得出基因表达的差异与DNA甲基化的改变无关的结论。其次，这些研究关注的是已经发现的与OA有关联的基因，因此无法鉴定出可能在疾病过程中具有重要作用的新通路。正因为如此，近3年来全基因组DNA甲基化的研究迅速开展起来。

3 全基因组甲基化研究

到目前为止，已发表的OA甲基化组学的研究大多数都是使用Illumina人类甲基化27K和450K磁珠芯片[14-20]。27K芯片能检测位于14 500个基因的27 000个CpG位点的甲基化水平，而450K芯片则覆盖了99%的RefSeq基因的485 577个CpG位点。其他的OA甲基化组学研究的检测方法包括：简化代表性亚硫酸氢盐测序法(RRBS)[21]，Agilent人类启动子芯片244K阵列[22]，或5′-羟甲基胞嘧啶抗体免疫共沉淀后测序(5hmC Me-DIP-seq)[23]。目前，Illumina公司已研发出更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)，包含了853 397个CpG位点[24]，但目前尚未见该芯片用于OA甲基化组学研究的相关报道。

关节软骨的甲基化组学的研究策略主要有4种：①比较非OA关节软骨和OA关节中未损伤的软骨[15-16]；②比较髋OA和膝OA关节中完好的未被侵蚀的软骨[16-17]；③比较同一个关节中完整的软骨和被侵蚀的软骨[18-19，22，25]；④比较体外培养的OA患者和非OA病例的软骨细胞[23]。除了关节软骨/软骨细胞的甲基化组学，还有研究比较了骨质疏松患者和OA患者的股骨头骨小梁[16]，以及相同关节中完整软骨和被侵蚀软骨所对应的软骨下骨[20]。尽管只检测了人类基因组2 800万个CpG位点中的很小一部分，但这些研究为阐明OA相关的甲基化改变的基因组区域、这些改变所涉及的基因和通路提供了重要的信息。

这些研究所鉴定出的差异化甲基化CpG位点(DMSs)或差异化甲基化区域(DMRs)，大多数不在基因的启动子区域，而是集中位于基因体、基因间隔区或增强子区域。基因的增强子可能是调控另一个完全不同的基因的表达，而基因体的甲基化可能与mRNA的剪接和其他启动子的转录相关[3-4]。这也许能解释为什么髋OA和膝OA软骨的DMRs中只有10%与所在基因的差异化表达相关[17]。因此，在对非启动子区域含有DMSs/DMRs的基因进行基因本体和通路分析时需要考虑到这些因素，阐明甲基化的变化对基因表达的作用是一项充满挑战的工作。

尽管各项研究存在技术和生物学上的差异，但根据目前已发表的全基因组甲基化研究可以得出几个关键性的结论。①髋和膝关节软骨的甲基化组学是不同的，且与疾病的状态或关节损害的程度无关[16-17]，甚至患者的相同关节也具有不同的表观遗传组学[15-16，26]。这些结果对疾病的诊断、治疗和组织工程研究具有重要意义。②OA与非OA关节软骨相比较[15-16]或者相同关节中完整软骨和受侵蚀的软骨相比较[18]，DMSs均富集位于具有免疫学功能的基因上。此外，髋OA和膝OA患者亚组的炎症基因的甲基化发生改变[15-16]，对髋OA进行炎症性聚类分析发现，这些变化与肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)1A、IL6、MMP13、ADAMTS5和锌转运体基因的转录增加相关[26]。这些研究提示DNA甲基化在调节关节软骨的炎症中具有重要的作用。转化生长因子β(TGF-β)通路是OA重要的信号通路，该通路的组成部分及其下游靶基因富集了许多与OA疾病状态[16]、疾病进展[19]、软骨侵蚀有关的DMSs，而软骨下骨也会发生甲基化的改变[18，20]，OA的软骨细胞呈现低甲基化状态[23]。③甲基化组学的研究为骨骼发育、肢体形态生成在OA易感性方面的作用提供了依据。编码同源盒转录因子基因(包括在肢体发育中至关重要的Hox基因)的甲基化状态在髋和膝关节软骨之间[16-17]、晚期膝OA[19]和OA患者的股骨头骨小梁[14]中均存在差异。④关节软骨退变也会影响邻近的软骨下骨的甲基化组学，关节软骨和软骨下骨中ERK/MAPK，PI3K和NFAT信号相关的基因也出现了与损害相关的甲基化改变[20]。

软骨细胞的甲基化组学具有异质性，受到关节来源、疾病状态等因素的影响，因此要明确甲基化组学的差异如何通过分子生物学机制来改变软骨细胞的表型，将是一项充满挑战性的工作。每一项甲基化组学研究都会鉴定出成百上千个DMSs/DMRs，因此很难确定选择其中哪些位点或区域进行后续的功能学研究。选取DMSs/DMRs的方法之一，是选择在多项相似试验设计的研究中均被证实的位点或区域。但是，要比较不同的甲基化检测技术所鉴定出的DMSs/DMR非常困难，因为需要对芯片技术和RRBS、MeDIP-seq等测序方法检测出来的CpG位点的甲基化数据进行重叠，而这些数据并不是都能公开获取。即使是同样使用450K芯片的研究，由于探针的排除标准，P值的校正和阈值，判断最小甲基化差异的显著性水平都有所不同，这些研究所鉴定出的DMSs/DMRs也不能直接进行比较。尽管存在这些问题，数据库中使用相似试验设计的450K芯片所鉴定出的DMSs也有明显的重叠部分。例如，两项独立研究鉴定出的髋OA和膝OA关节软骨DMSs中，有34.1%的差异性位点是重叠的，并且表现为相同趋势和相似程度的甲基化差异[16-17]。同样，髋OA完整软骨和被侵蚀软骨的DMSs中约有71%在髋和膝样本数据联合分析时仍然存在甲基化水平的差异[18，25]。尽管髋和膝关节软骨具有不同的表观遗传学特征，但非OA和OA膝关节软骨的DMSs中有超过1/3的差异性位点在非OA和OA髋关节软骨中表现出相同趋势的甲基化改变[16]。由于关节软骨样本来自于不同的地理位置，那么这些研究中重叠的部位在很大程度上是独立于环境因素的。因此，不受关节部位、OA亚型或者生活方式的影响，始终表现为相同甲基化改变的DMSs，是今后靶向研究的良好候选位点。

4 表观遗传治疗在OA疾病中的应用

表观遗传修饰是不改变基因序列的修饰，相对基因治疗更加安全。目前已有很多关于表观遗传修饰治疗疾病的报道，主要是用于肿瘤及血液疾病的治疗。目前最主要的修饰DNA甲基化的药物是5-杂氮胞苷(5-AzaC)和5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)，先后于2004年和2006年被美国食品药品监督局(FDA)批准用于血液系统肿瘤的治疗。这两种药物均为DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂，通过与DNMT共价结合，降低DNMT的生物活性，使抑癌基因去甲基化而被重新表达，因而已被成功用于血液系统疾病的治疗[27]。在DNA甲基化修饰药物的研究过程中，陆续发现治疗心血管疾病的药物具有一定的去甲基化作用，例如抗高血压药物肼屈嗪、抗心律失常药物普鲁卡因胺等[28-29]，此外研究发现中药单体姜黄素具有抑制DNMT的作用[30]。但这些药物去甲基化作用较弱，且作用机制不清，存在较多争议，限制了其在临床的应用。

目前已有部分学者尝试将5′-杂氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)用于OA软骨细胞的体外干预。Iliopoulos等[9]发现，5-Aza-dC能够使软骨细胞leptin启动子甲基化水平降低、mRNA表达增加，继而激活MMP-13。Kim等[31]报道OA关节软骨细胞与10 μmol/L 5-Aza-dC共培养8天后，软骨细胞 SOX-9启动子区域的6个CpG岛甲基化水平降低，定量PCR提示SOX-9 mRNA表达增加，蛋白印迹(Western-blot)检测SOX-9蛋白表达增加。此外，5-Aza-dC与股骨颈骨折患者的软骨细胞共培养5周后，COL9A1mRNA表达明显升高，启动子区域的CpG位点甲基化程度变化趋势不一。而与OA软骨细胞体外共培养的过程中，5-Aza-dC能降低COL9A1的DNA甲基化水平，增加COL9A1的表达[12]。但是，这两种药物对于DNMT没有选择性，特异性低，化学稳定性差，同时还具有肾毒性、骨髓毒性等副作用。因此，进一步研发高特异性、高选择性、低毒性的DNA甲基化修饰药物，靶向调节特定基因的DNA甲基化水平，启动或抑制特定基因的表达，从而达到疾病的缓解，将是今后药物开发的热点。

5 今后OA DNA甲基化的研究方向

近几年来OA关节软骨的DNA甲基化研究尤其是甲基化芯片技术的应用，使我们对表观遗传学在OA中的作用有了更加深刻的理解。今后该领域的研究可以从以下几个方面进行更加深入的探索。

第一，由于甲基化组学研究及其鉴定出的DMSs/DMRs的数量不断增多，建立能够整合研究结果的数据库显得尤为必要。鉴于大多数甲基化组学研究都使用Illumina芯片技术，应当对探针排除标准、基因注释、多重检验校正方法、界定DMSs的P值和甲基化差异的阈值等达成共识。这将有利于研究间的直接比较，一项研究的数据可以用于另一项独立样本研究的验证分析。此外，更高通量的MethylEPIC磁珠芯片(850K)的诞生和应用[24]，将为OA的DNA甲基化研究提供更多的信息和数据。

第二，整合遗传学、转录组学和甲基化组学的研究数据。甲基化状态和基因表达之间应当是相关的，但是某些相关性的缺失可能是由于过去认为对细胞没有调控作用的因素造成的。这将有助于我们对基因表达临时调控的认识。同样，DNA基因型与不同的甲基化是否有关也需要进行评估。如果在OA遗传学危险因素有关的DNA多态性位点上，等位基因的类型能影响到邻近区域CpG位点的甲基化状态，这将有助于解释基因多态性如何影响OA的易感性。

第三，DNA甲基化研究应该扩展到关节其他组织。滑膜、软骨下骨等其他受累部位也可能会提供有用的信息。此外，DNA甲基化的研究还应该扩展到比软骨更易获取的组织。人类组学研究的目标之一，就是能够在更易获取的组织中例如血液、唾液，检测到在病变组织中所观察到的异常改变，从而鉴别出尚未发病的易感人群。

第四，进一步研发具有特异性靶向作用的表观遗传修饰药物。目前已有的DNA甲基化传修饰药物，其去甲基化作用缺乏特异性，不能靶向作用于某个特定基因并改变其DNA甲基化状态，稳定性较差，毒副作用明显，严重限制了其在疾病治疗中的应用。因此，研发高效力、高选择性的新一代DNA甲基化修饰药物，靶向调节特定基因的表达，从而达到疾病的缓解，是今后药物开发的方向之一。

今后，研究者们将通过遗传学、转录组学和甲基化组学对参与OA发病的基因和区域进行更加详细的功能学特征的阐明。总之，这些研究将有可能鉴定出OA新的病因学通路、疾病表型，发现新的诊断和预后的生物标记物，以及新的治疗靶点。

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四川省科技厅重点研发项目(2017SZ0128);四川省卫生厅基金项目(130322)

魏萌，Email: weimengwm@sina.com

R684.3

A

1004-583X(2017)09-0824-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.09.023

2017-05-22 编辑:武峪峰