热带假丝酵母唑类耐药相关基因的研究进展

唐娜，郭大文

哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001

热带假丝酵母唑类耐药相关基因的研究进展

唐娜，郭大文

哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001

临床上热带假丝酵母(又称热带念珠菌)的分离率越来越高，唑类抗真菌药物因较低的细胞毒性且大多可口服给药，是治疗热带念珠菌感染的常用药物。我国耐唑类药物热带念珠菌的分离率较高，因此有必要了解其具体机制，为寻求新的药物作用靶点提供依据。目前认为,与热带念珠菌唑类耐药有关的主要机制有靶基因ERG11过度表达和突变、编码转录因子的upc2基因过度表达和突变、外排泵基因过度表达及其他相关基因过度表达等。本文就目前热带念珠菌唑类耐药机制的基因水平研究进展进行综述。

热带假丝酵母；ERG11基因；唑类耐药；基因突变

假丝酵母(又称念珠菌)属引起的真菌感染在世界范围内显著增多，非白念珠菌(non-albicansCandida，NACA)的分离率也逐年上升[1]。几十年来，热带念珠菌在不同地域的癌症、中性粒细胞减少症、恶性肿瘤和长期药物治疗患者中已成为排名一二的NACA[2]。研究发现，耐唑类药物热带念珠菌的分离率呈上升趋势[3-4]。中国侵袭性真菌耐药监测网(CHIF-NET)数据显示[4]，近5年(2009年8月—2014年7月)氟康唑的耐药率从11.2%增至42.7%，伏立康唑的耐药率从10.4%增至39.1%；2013—2014年耐唑类药物热带念珠菌的分离率呈迅速上升趋势，且分离率上升与临床药物使用量无关。全球SENTRY监测报告显示[5]，来自31个国家(2013年)的热带念珠菌中，氟康唑耐药率为 11.6%，其中 81.8% 来自亚太地区，31.8% 来自中国。

1 靶基因ERG11过度表达和突变

1.1 唑类药物的作用靶酶

14-α去甲基化酶(14α-demethylase，14-DM)是麦角固醇合成的关键酶，由ERG11基因编码合成[6]。麦角固醇是维持细胞膜正常的结构，是念珠菌细胞膜的主要固醇，可影响多种膜结合酶的功能。固醇合成阶段包括形成角鲨烯、角鲨烯转化为羊毛甾醇后生成麦角固醇，其中麦角固醇的形成是真菌合成固醇的特有阶段[7]。唑类药物与14-DM结合，阻止酶底物与14-DM结合，影响羊毛甾醇14α-甲基的羟基化反应，从而抑制真菌细胞膜中麦角固醇的生物合成，发挥抗真菌作用。

1.2 ERG11过度表达

ERG11过度表达增加了细胞中靶酶的量，需更高效力的唑类药物与靶酶结合才能达到抑菌效果[6]。研究证实，耐氟康唑热带念珠菌中ERG11过度表达[8-11]。Jiang等[8]研究中国52株来自临床的热带念珠菌发现，耐唑类药物热带念珠菌中ERG11平均表达水平高于敏感菌4倍以上，麦角甾醇含量增加，对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐药的分离株中ERG11表达水平比单独耐氟康唑或伊曲康唑的分离株更高。

1.3 ERG11突变

ERG11突变可引起其编码的酶的活性和三维结构发生改变，降低其对唑类药物的亲和力，使药物不能有效发挥作用[6]。临床研究发现，热带念珠菌中越来越多的ERG11突变与唑类耐药相关。耐唑类药物热带念珠菌中，可能与耐药相关的氨基酸置换有D81A[12]、Y132F[8-9,12-13]、S154F[7-9,12]、R245K[10]、Y221F[10]、V362I[10]、K143Q[9]、K143R[14]等。部分研究[8-9,12]发现Y132F和S154F在耐药株中同时出现，有实验[8]证实ERG11突变导致的Y132F和S154F置换降低了酿酒酵母对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑(尤其是对氟康唑和伊曲康唑)的敏感性。有研究发现[14-15]K143Q、K143R置换位于ERG11的唑类结合活性位点附近。根据建立的蛋白质同源性模型和Chau等[16]的研究，认为K143Q、K143R置换可能引起热带念珠菌对唑类药物耐药。由于14-DM的活性位点在血红素远端，深埋于蛋白内部，唑类药物需通过较长的通道才能到达[17]。三维分子建模软件分析表明，D81A、Y132F和S154F分别位于唑类药物进出通道的上方、通道内和通道开口,可能影响唑类药物进入通道，导致14-DM与氟康唑的亲和力下降而产生耐药[12]。在耐唑类药物热带念珠菌中发现的氨基酸置换，还需进一步的实验证实和全面的流行病学研究以确定具体机制。在氟康唑剂量依赖株和氟康唑耐药株的ERG11中也会出现某些沉默突变，虽不改变氨基酸序列，但可能影响蛋白与药物相互作用位点的结构[18]。因此，热带念珠菌ERG11基因的沉默突变可能与耐药有关，还须进一步研究证实。

2 upc2基因过度表达和突变

2.1 锌族转录因子Upc2p

upc2基因编码锌族转录因子Upc2p，这是一种具有调控基因表达功能的蛋白，为真菌所特有。已证明，ERG11的上调和突变是热带念珠菌耐唑类药物的主要机制之一[8]。Upc2p具有转录调节功能，可调控ERG11表达，有必要对其进一步研究。目前，对热带念珠菌upc2的研究较少，但越来越受重视。

2.2 upc2基因过度表达和突变

Jiang等研究upc2的表达和序列改变，结果显示31株耐唑类药物热带念珠菌中upc2显著过度表达[19]，对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐药的分离株中upc2表达水平比单独氟康唑或伊曲康唑耐药株更高。upc2启动子区域含有T118G和G155A突变，两种突变可同时存在(在多重耐药分离株中始终同时存在)。他们还检测到G392E置换，并以酿酒酵母为表达宿主，证明G392E置换可显著降低酿酒酵母对氟康唑和伊曲康唑的敏感性。Choi等[11]对热带念珠菌upc2进行测序，发现突变基因导致的氨基酸置换，但这些突变出现在未过表达ERG11的氟康唑敏感菌株中，因此进一步研究upc2基因的改变对调控ERG11功能的影响很有必要。upc2过度表达和突变对ERG11的影响而导致的耐药还需更多研究证实，未来可深入研究upc2启动子 T118G和G155A突变在热带念珠菌Upc2p转录调控ERG11中的具体作用。

3 外排泵基因cdr1和mdr1过表达

3.1 外排泵ABCT和MFS

目前认为，真菌细胞中与唑类耐药相关的外排泵主要有两类: 一类是ATP结合盒转运蛋白家族(ATP binding cassette transporter，ABCT)，为一种能量依赖型外排泵，通过水解ATP获得能量，以主动转运的方式增加药物外排，从而降低细胞内药物浓度而产生耐药; 另一类是主要易化扩散载体超家族( major facilitator superfamily，MFS)，为非能量依赖型载体，主要依靠跨膜质子浓度差，以被动运输的方式向细胞外泵出药物，降低细胞内药物浓度而产生耐药[20]。可能与热带念珠菌唑类耐药相关的外排泵有：cdr1基因编码的Cdr1p是对唑类药物产生耐药的最主要ABCT，mdr1编码的Mdr1p是近年来关于唑类耐药研究最多的MFS[20]。

3.2 外排泵基因cdr1和mdr1过表达

谢宏等[20]针对药物外排泵基因，对临床分离的热带念珠菌氟康唑敏感株和耐药株中的cdr1和mdr1表达进行研究，结果显示两种外排泵基因在敏感株和耐药株中均有表达，且耐药株中的表达高于敏感株，与文献[10,21]报道一致。Choi等[11]分析热带念珠菌发现，mdr1和cdr1表达在氟康唑低敏感株 (最低抑菌浓度1～2 μg/mL)和氟康唑不敏感株 (最低抑菌浓度4～64 μg/mL)中均明显高于对照组(最低抑菌浓度 0.125～0.5 μg/mL)。有学者在耐唑类药物热带念珠菌中也观察到ABCT上调[14]，认为外排泵基因的过度表达可能与热带念珠菌耐唑类药物相关。有研究显示，氟康唑耐药株mdr1过表达率显著高于敏感株，而耐药株cdr1过表达率与敏感株无显著统计学差异，表明热带念珠菌临床分离株的耐药与MFS高表达相关[9]。Jiang等[8]研究mdr1和cdr1表达时发现，氟康唑敏感株与耐药株之间无显著差异，与Vandeputte等[22]的研究结果一致。因此有学者认为，与ERG11相比，外排泵基因似乎在热带念珠菌耐唑类药物中不起关键作用。目前为止，直接描述这些外排泵基因潜在作用的实验尚未在热带念珠菌中进行，仍需进一步的实验证实和全面的流行病学研究。

4 其他相关基因的过度表达

有研究发现[23]，耐唑类药物热带念珠菌中，sod、oat、acoat、dapaat和abat这5种基因过度表达可能是唑类耐药的潜在新标记。5种基因编码的酶包括涉及抗氧化防御的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、鸟氨酸氨基转移酶(ornithine aminotransferase，OAT)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(acetylornithine aminotransferase，ACOAT)、腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基转移酶(diaminopelargonic acid aminotransferase，DAPA AT)和4-氨基丁酸氨基转移酶(4-aminobutyrate aminotransferase，ABAT)。后4种属于磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)依赖酶，在许多真菌细胞周期中发挥重要生理作用。大多数抗真菌药物可通过在酵母细胞中产生高水平的胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)诱导细胞死亡。SOD可催化超氧自由基向过氧化氢和二氧化碳转化，在保护细胞免受超氧化物毒性方面发挥重要作用[24]。耐唑类药物热带念珠菌中sod过度表达，可能减少ROS诱导的细胞死亡，从而使热带念珠菌产生耐药。oat、acoat、dapaat和abat编码的酶属于PLP依赖性天冬氨酸氨基转移酶家族，在三羧酸循环前体生成中起主要作用，其过度表达导致真菌细胞产生大量ATP。念珠菌产生耐药的机制之一是真菌细胞膜上的ABCT通过ATP水解获得能量，从而有效将药物排出细胞外[25]。耐唑类药物热带念珠菌中oat、acoat、dapaat和abat过度表达，产生大量ATP，有助于ABCT将细胞内药物排除而产生耐药。综上所述，sod、oat、acoat、dapaat和abat过度表达可能与热带念珠菌耐唑类药物有关。

5 结语

热带念珠菌的唑类耐药率升高给临床治疗带来了阻力，耐药性的形成与相关耐药基因的过度表达和突变有一定关联。但耐药机制有多种，相互之间作用复杂，仍需不断深入研究，从而为临床提供参考和理论依据。

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. GUO Dawen, E-mail: gdw0618@aliyun.com

Progressonazoleresistance-relatedgenesinCandidatropicalis

TANG Na, GUO Dawen

DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China

Detection rate ofCandidatropicalis(C.tropicalis) is increasing in clinical practice. Azole antifungal agents are commonly used in the treatment ofC.tropicalisinfection because of their low cytotoxicity and oral administration. In China, there is a high rate of isolation of azole resistantC.tropicalis. It is necessary to understand the azole resistance mechanism ofC.tropicalis, which may provide a base for new drug targets. At present, the main mechanisms associated with resistance ofC.tropicalisto azoles are the overexpression and mutation of the target geneERG11, the overexpression and mutation ofupc2 gene encoding a transcription factor, the overexpression of efflux pump genes and other related genes. In this paper, the current progress on the latest azole resistance mechanism ofC.tropicalisis reviewed.

Candidatropicalis;ERG11; Azole resistance; Gene mutation

郭大文

2017-07-07)