艰难梭菌毒素致病基因调控机制和抗毒素治疗

林倩云 费稼希 陈 烨

南方医科大学附属南方医院消化内科 广东省胃肠实验重点实验室(510515)

艰难梭菌毒素致病基因调控机制和抗毒素治疗

林倩云 费稼希 陈 烨*

南方医科大学附属南方医院消化内科 广东省胃肠实验重点实验室(510515)

艰难梭菌(C.difficile)是一种重要的院内感染病原体，是抗菌药物相关性腹泻的主要致病菌。C.difficile产毒菌株主要通过释放肠毒素A(TcdA)和细胞毒素B(TcdB)引起结肠损伤和炎症发生。研究发现C.difficile相关性疾病(CDAD)的严重程度与宿主体内细菌毒素水平相关。然而，不同菌株产毒能力差异较大，与毒素产生过程中涉及的基因调控密切相关。本文就C.difficile毒素致病基因调控机制和抗毒素治疗作一综述。

难辨梭菌； 细菌毒素类； 基因调控； 治疗

艰难梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)为革兰阳性专性厌氧梭状芽孢杆菌，是一种重要的院内感染病原体，是抗菌药物相关性腹泻的主要致病菌。正常肠道菌群可有效抑制C.difficile的定植和繁殖。抗菌药物、化疗药物等因素可破坏肠道菌群平衡，导致该菌种过度生长，释放肠毒素A(TcdA)和细胞毒素B(TcdB)引起结肠损伤和炎症发生。C.difficile相关性疾病(CDAD)的严重程度可为自轻微自限性腹泻到脓毒性休克、多器官衰竭，即使给予万古霉素、甲硝唑治疗，死亡率仍有7%，且发病率和死亡率呈逐年增加趋势[1-2]。研究[3]发现CDAD的严重程度与宿主体内细菌毒素水平相关。然而，不同菌株产毒能力差异较大，与毒素产生过程中涉及的基因调控密切相关。目前C.difficile感染过程中的致病和毒素调控机制仍未完全明确，重症或反复发作性患者缺乏确切有效的治疗措施。本文就C.difficile毒素致病基因调控机制和抗毒素治疗作一综述。

一、TcdA和TcdB

1. 功能区域：C.difficile的致病性主要依赖于两种致泻毒素，即TcdA[2710 aa, 308 kDa(1 Da=0.992 1 u)]和TcdB(2366 aa, 270 kDa)[4]。迄今为止发现的所有产毒菌株均可合成TcdB，而TcdA编码序列C端的重复寡肽序列常发生片段缺失，导致TcdA不能正常合成[5]。目前除TcdA+B+、TcdA-B+菌株外，还发现了TcdA+B-C.difficile变异菌株，但尚无相关流行病学资料[6]。TcdA和TcdB隶属大分子梭菌属糖基化单链蛋白质[7]，两者49%的氨基酸序列一致[8]，63%的氨基酸序列相似[8-9]，包括至少4个关键区域[10-12]：N末端的葡萄糖基转移酶区域(GTD)；半胱氨酸蛋白酶区域(CPD)；转运功能区(TD)，包括孔道形成蛋白和疏水区域；以及肽链C端可结合的重复寡肽序列(CROPs)构成的受体结合区域(RBD)。对以上4个蛋白片段构建失活突变以及缺失功能学研究[8]发现，具有酶活性的GTD片段和可形成孔道的TD片段是毒素发挥毒性的必须成分，而CPD和C末端的CROPs为非必须成分，失活或缺失该区域菌株的毒力仅较野生型菌株低10～100倍。

2. 入胞和致病机制：TcdA/B的内吞摄取作用为网格蛋白依赖性，两种毒素通过受体介导的内吞作用形成核内体，空泡型ATP酶(V-ATpase)可诱导核内体酸度增加[13]，酸性环境诱发毒素蛋白构象变化，毒素TD疏水片段插入核内体膜形成跨膜孔隙，导致GTD和CPD片段进入细胞质[10,12]。在细胞质中，宿主六磷酸肌醇(IP6)变构激活CPD结构域，毒素自催化分解释放可发挥葡萄糖基转移酶活性的GTD片段，其可特异性修饰和失活结合于苏氨酸残基上的Rho家族小G蛋白，包括Rho、Rac以及Cdc42[14]，引起信号转导级联反应受损，进而导致肌动蛋白解聚和细胞坏死，触发炎症级联反应，破坏细胞间紧密连接，使肠道黏膜通透性增加，导致组织损伤、腹泻以及伪膜性结肠炎[4,15]。尽管TcdA与TcdB的蛋白结构和IP6介导的激活机制相似，但TcdB诱导细胞凋亡的毒性至少为TcdA的100倍[8]，两者自催化分解的效率差异较大，Zhang等[16]的研究发现，TcdA的CROPs片段可阻碍IP6介导的CPD激活，此可能造成TcdA毒力较低，但具体机制尚待进一步研究。

近年研究[12,17]发现，TcdB蛋白aa 1106位点位于TD疏水域的亮氨酸残基对毒素在核内体膜上形成孔道的能力有决定性作用，此进一步解释了TcdB的入胞机制，但该作用尚未在TcdA中得到验证。一般认为TcdA/B需通过CROPs与受体细胞结合发挥毒性作用，但研究[11,18]发现完全缺失CROPs片段的毒素蛋白在高浓度情况下仍可表现出细胞毒性，提示存在其他受体结合位点或内吞途径。有研究[10]发现，TcdB的细胞受体硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)、脊髓灰质炎病毒样受体3(PVRL3)与TcdB的结合位点均在CROPs片段之外。Manse等[11]的研究亦进一步证实了TcdB除CROPs片段(1851～2366)外，亦存在两个片段aa(1372～1493)、aa(1493～1848)可独立地与哺乳动物细胞结合并介导TcdB入胞。

二、C. difficile致病基因座(pathogenicity locus, PaLoc)

C.difficile的PaLoc存在于所有产毒菌株中，长度约为19.6 kb，PaLoc区域包括毒力编码基因tcdA、tcdB、tcdR、tcdC以及tcdE 5个基因[19]。以往研究认为PaLoc在染色体上的位置固定，然而Monot等[6]通过对3株C.difficile非典型菌株行基因组分析发现，PaLoc可位于不同基因位点，并提出PaLoc进化的新模式：由2个单毒素PaLoc(mono-toxin PaLoc)进化融合为1个二元毒素PaLoc(bi-toxin PaLoc)。PaLoc能从产毒菌株转移至非产毒菌株，常与接合转座子(conjugative transposons, CTn)协同转移[20-21]。PaLoc区域的基因水平转移以及基因重组是导致毒素多样性的主要机制[6]。

大多数非产毒菌株中PaLoc缺失，其位点被115 bp/75 bp非编码的高度保守序列取代[5,22]，因而普遍认为非产毒菌株不具有致病性。研究[23]表明，非产毒C.difficile或其孢子可治愈复发性C.difficile感染，并抑制产毒菌株在肠道内定植。进一步通过基因组比较分析发现，非产毒菌株的基因表达谱与产毒菌株类似[22]。非产毒株可通过水平转移获得PaLoc，使其毒素水平与产毒菌株无显著差异[21]，因此明确非产毒株在何种条件下可获得PaLoc，以及具备何种特征的非产毒株易获得PaLoc对评估其安全性至关重要。

1. tcdA和tcdB基因：tcdA和tcdB在tcdR、tcdC以及tcdE等基因调控下分泌TcdA和TcdB蛋白。tcdA、tcdB以及tcdR在细菌静止期转录，而tcdC转录发生于对数生长期[24]，转录时间上的差异提示在转录水平上，tcdR可能对tcdA、tcdB表达发挥促进作用，而tcdC可能发挥抑制作用。目前关于tcdE的调控作用尚存在争议，李先平等[25]的研究表明，tcdE与tcdA和tcdB的转录呈正相关，提示tcdE对tcdA、tcdB发挥正调控功能。

2. tcdR基因：tcdR编码约22 kDa的碱性蛋白TcdR，其功能为RNA聚合酶的σ亚基，可激活tcdA、tcdB及其本身转录。在其他致病性梭状芽孢杆菌(肉毒杆菌、破伤风杆菌以及产气荚膜菌等)中亦发现了功能与TcdR功能类似的激活毒素基因表达的蛋白。tcdR及其毒素表达受细菌营养条件、生长温度以及生长阶段等因素影响。因此，如何在不同条件下有效激活tcdR表达，可能成为诱导毒素基因转录的关键。

3. tcdC基因：tcdC编码约26 kDa的酸性胞膜蛋白TcdC，通过干扰已结合TcdR的RNA聚合酶识别tcdA、tcdB启动子，从而抑制毒素基因表达[19,24]。游离TcdR和与RNA聚合酶结合的TcdR均对TcdC敏感。然而一旦与tcdA启动子结合的开放性转录复合体形成，TcdC即失去干扰能力，表明TcdC仅在转录起始阶段对σ因子而非RNA聚合酶核心酶起作用。

4. tcdE基因：tcdE编码高度疏水蛋白TcdE。Govind等[26]从一级结构特征及其序列的相似性推测TcdE隶属于穴蛋白classⅠ 家族，其功能可能与该家族中λ 噬菌体产生的具有裂解细菌作用的S蛋白类似，认为与毒素的外分泌有关。然而研究[27]发现，在C.difficile标准菌株VPI0463中，tcdE失活并不影响毒素释放和分泌。tcdE编码序列上存在3个潜在起始密码子(AUG)，分别自位点1(Met1)、25(Met25)以及27(Met27)翻译成TcdE166、TcdE142以及TcdE140三种蛋白亚型。Govind等[28]的研究证实了TcdE对高毒力菌株(027型)分泌TcdA、TcdB的必要性，并且发现过表达TcdE166和TcdE142可导致菌体死亡，而TcdE140对菌体存活几乎无影响，然而自然状态下TcdE介导的毒素分泌并未伴随细菌裂解或裂解的菌体极少，可能由于菌体调控了TcdE三种蛋白亚型的表达比例。如何激活tcdE转录及其三种蛋白亚型的调控机制尚不明确。

三、二元毒素及其基因调控

包括NAPI/027型在内的约17%～23%的C.difficile产毒株可分泌C.difficile二元毒素(C.difficilebinary toxin, CDT)[6]。CDT包括两个独立的蛋白亚基，即具有酶活性的CDTa和具有结合能力的CDTb，分别由cdtA、cdtB基因编码。Carter等[14]的研究表明，CDT的产生受LytTR家族反应调节蛋白CdtR调控。CdtR由位于cdtA/B上游的cdtR编码，严格调控cdtA/B基因表达，该基因区域称为CdtLoc。缺失完整cdtA/B基因或携带cdtA/B伪基因的菌株，其cdtR基因亦缺失，导致CdtLoc不完整或由一段68 bp的保守核苷酸序列取代。近年研究[6]发现，某些非典型菌株的CdtLoc序列与PaLoc连接，位于相同的基因组区域。

四、新治疗途径

2015年美国C.difficile感染临床实践指南[29]仍推荐使用万古霉素、甲硝唑作为C.difficile感染的一线治疗方案，然而抗菌药物易进一步破坏肠道微生态，加重菌群失衡，从而引起感染复发。因此有必要转变治疗模式，改变单纯使用抗菌药物作为一线治疗的方案。动物实验[30]证实不产毒菌株不引起任何疾病症状，因此研究多关注于中和毒素而非一味杀灭细菌。因毒素的作用位点在肠道，口服毒素中和制剂可在肠道内阻断毒素，抑制毒素穿透肠道屏障进入血液循环。诸多可阻断毒素作用的小分子抑制剂被陆续发现，按其阻断位点不同目前可分为以下几种类别。

1. 阻断毒素与宿主细胞结合：默克公司研发了用于中和TcdA和TcdB的特异性人源单克隆抗体Actoxumab(ACT)和Bezlotoxumab(BEZ)。临床试验[31]中单独使用ACT的治疗组在中期分析后因有效性和安全性原因停止试验；单独使用BEZ组的感染复发率为16.5%，显著低于安慰剂组(26.6%)。目前默克公司已提交BEZ的上市申请。使用单克隆抗体被动免疫可最大程度避免患者在急性感染后复发，对有复发感染高风险的患者具有良好的成本效益[32]。然而对于高危人群是否需早期预防性使用毒素中和抗体尚存争议。Yuan等[10]的研究发现，CSPG4以及由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成的多肽具有TcdB细胞受体的功能，抑制CSPG4功能或其表达可显著降低TcdB毒性，此为阻断毒素与宿主细胞结合提供了新途径。

2. 抑制核内体酸化：核内体酸化可诱发毒素蛋白构象变化，导致毒素释放入胞。Slater等[33]对作用于宿主细胞的可抑制核内体酸化的化合物进行研究，结果显示刀豆素A对细胞免受TcdB毒性作用的保护率为100%、川楝素为30%、腐败菌素B为26%～50%。Tam等[8]的研究发现，抗疟药米帕林可通过抑制核内体酸化，从而有效抑制TcdB诱导的细胞坏死。上述研究进一步证实了抑制核内体酸化的小分子化合物的潜在治疗价值。

3. 抑制葡萄糖基转移酶活性：毒素蛋白中具有葡萄糖基转移酶活性的GTD片段可破坏细胞信号转导级联反应，从而诱导细胞凋亡，对于毒素发挥毒性作用不可或缺。Tam等[8]的研究发现，天然黄酮类化合物根皮素可非竞争性直接抑制毒素GTD的活性，且呈剂量依赖性。

4. 抑制毒素自催化过程：毒素蛋白通过自催化分解过程释放具有葡萄糖基转移酶活性的GTD片段，阻断该过程可阻断炎症级联反应。Bender等[34]的研究发现，低分子量化合物依布硒可抑制TcdB对细胞的致死作用。依布硒含有活性硒基团，可共价结合半胱氨酸残基阻断毒素的自催化过程。

五、总结与展望

尽管近年来对C.difficile毒素的研究越来越关注其基因调控机制，然而基因的转录、表达过程尤为复杂，难以对其定性和定量分析。近来研究[35]发现粪肠球菌的碱性磷酸酶基因phoZ可作为报告基因定性或定量分析C.difficile的基因转录，这将为进一步研究基因操纵和分子分析提供高效便捷的方法。研究[36]发现C.difficile的毒素基因表达亦受群体感应系统的调节，通过破坏该系统可切断细菌间转导信号，从而削弱菌体产毒的能力，这为研究非抗菌药物治疗C.difficile感染提供了新思路。此外，研发针对毒素的抗C.difficile感染疫苗具有潜在可能性，抗C.difficile疫苗为预防该菌感染提供了一种有效且相对价廉的方法。然而，接种疫苗或单克隆抗体治疗均不能清除C.difficile在肠道的定植，因而隔离传染源仍是防控C.difficile感染的最主要措施。

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(2016-03-22收稿；2016-09-28修回)

Regulatory Mechanism ofClostridiumdifficileToxin-associated Pathogenic Gene and Anti-toxin Treatment

LINQianyun,FEIJiaxi,CHENYe.

DepartmentofGastroenterology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofGastroenterology,Guangzhou(510515)

CHEN Ye, Email: yechen@smu.edu.cn

Clostridiumdifficile(C.difficile) is a major nosocomial infection pathogen and the principal causative agent of antibiotic-associated diarrhea. The toxigenicC.difficilestrains cause colonic injury and inflammation mainly by secreting enterotoxin A (TcdA) and cytotoxin B (TcdB). The severity ofC.difficileassociated disease (CDAD) is correlated to the toxin level during host infection. However, the toxigenic capacity ofC.difficilevaries widely among strains, which correlates with the gene regulation involved during toxin production. This article reviewed the regulatory mechanism ofC.difficiletoxin-associated pathogenic gene and anti-toxin treatment.

Clostridiumdifficile; Bacterial Toxins; Gene Regulation; Therapy

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.01.011

*本文通信作者，Email: yechen@smu.edu.cn