利用纳米碳与亚甲蓝示踪甲状腺乳头状癌前哨淋巴结的对比研究

陈杰 周晓红 李真华 葛家华 何云 张玉莲

·论著·

利用纳米碳与亚甲蓝示踪甲状腺乳头状癌前哨淋巴结的对比研究

陈杰 周晓红 李真华 葛家华 何云 张玉莲

目的 探讨亚甲蓝和纳米碳混悬注射液细胞染色示踪甲状腺乳头状癌前哨淋巴结（SLN）的价值。方法 选择130例甲状腺乳头状癌患者，按不平衡指数最小分配原则随机分为2组，分别用亚甲蓝及纳米碳行SLN活检术，记录SLN的位置及数目，随后行患侧功能性颈淋巴结清扫术，将SLN及清扫的淋巴结分别进行HE染色观察，采用t检验、c2检验、fisher确切概率法对数据进行统计学分析。结果 亚甲蓝组65例检出SLN 52例，27例为阳性，其检出率、灵敏度、准确率和假阴性率分别为80.00﹪、84.38﹪、90.38﹪、15.62﹪。纳米碳组65例检出SLN 61例，30例为阳性，其检出率、灵敏度、准确率和假阴性率分别为93.84﹪、90.91﹪、95.08﹪、9.09﹪，除检出率相比差异有统计学意义（c2= 5.482，P = 0.019），灵敏度、准确率、假阴性率相比差异无统计学意义（fisher确切概率法，P = 0.475、0.467、0.475）。两组所检出的SLN在各区的分布情况差异无统计学意义（c2=1.043、P = 0.791），两组均在Ⅳ区和Ⅵ区的检出率、阳性率最高，两组间差异无统计学意义（c2=1.043，P = 0.425；c2=0.012，P = 0.914）。结论 纳米碳与亚甲蓝在甲状腺乳头状癌术中细胞示踪SLN均具有可行性，能准确反映颈部淋巴结的状况，对甲状腺乳头状癌淋巴结的清扫具有指导意义，纳米碳较亚甲蓝能获得较清晰的术野，对SLN检出率高，值得推广。

甲状腺肿瘤； 前哨淋巴结； 纳米结构； 碳； 亚甲蓝； 细胞示踪

前哨淋巴结（sentinel lymph node，SLN）是指最早接受肿瘤淋巴引流的淋巴结，也是最早发生转移的淋巴结，SLN组织学检查能够较准确地预测区域淋巴结的状态[1-2]。检测SLN的转移状况可决定合理的淋巴清扫范围，避免不必要的淋巴清扫和再次手术的创伤，同时可以减少淋巴结复发、转移的发生，达到甲状腺乳头状癌手术根治目的。目前国内最常用的甲状腺癌SLN细胞染色示踪剂是亚甲蓝，也有研究证实了纳米碳的可行性[3]，为了进一步探讨亚甲蓝和纳米碳作为细胞示踪剂对甲状腺癌SLN的识别价值，近年来应用亚甲蓝及纳米碳对甲状腺癌SLN的识别进行对比研究，现报道如下。

资料与方法

一、临床资料

选择从2012年10月至2015年10月到重庆市肿瘤研究所接受手术治疗的甲状腺乳头状癌患者130例。纳入标准为：（1）临床诊断甲状腺癌，需行甲状腺腺叶加峡部切除或甲状腺全切除术和（或）颈淋巴清扫术患者；（2）既往和现在无重大精神疾患和意识障碍；（3）自愿参加研究并签订知情同意书。排除标准为：（1）曾接受过甲状腺癌手术或131Ⅰ治疗的患者；（2）术中冰冻和病理提示非甲状腺乳头状癌患者；（3）有重大精神疾患和意识障碍患者。将入组患者按不平衡指数最小分配原则随机分为对照组亚甲蓝示踪组和实验组纳米碳示踪组。亚甲蓝示踪组65例，年龄28～68岁，中位年龄（43±11）岁；纳米碳示踪组65例，年龄30～70岁，中位年龄（44±12）岁。两组在男女比例、患者年龄、肿瘤大小分布方面差异均无统计学意义（P > 0.05），患者的基本临床资料处于同一基线水平，资料具有可比性。

二、方法

1. SLN活检：两组患者均采用全麻，取平卧颈过伸位，肩部垫高，取颈部胸骨切迹上2 cm顺皮纹弧形切口，切开皮肤，皮下脂肪，于颈阔肌下翻瓣，切开颈白线后，在甲状腺假被膜外仔细游离、保持假被膜的完整性，充分显露甲状腺。分别将亚甲蓝及纳米碳注射在肿瘤周围上、下、左、右4点注射，总共注射亚甲蓝4 ml或纳米碳1 ml，亚甲蓝5 min内注射完，纳米碳3 min注射完毕，为防渗漏针头，在组织中潜行一段距离再推注，拔针后用钳夹针孔防止染料外溢影响视野。沿淋巴管走向进行解剖，寻找最先染色的淋巴结，即SLN（术中操作见图1）。详细记录SLN的数目和位置，然后行同侧甲状腺腺叶切除加峡部切除，送术中冰冻进一步明确诊断根据临床分期、性别、年龄及患者意愿等因素综合考虑制定是否行全甲状腺或近全甲状腺切除术，各组患者均行同侧功能性颈淋巴结清扫术，将染色的SLN及清扫的区域颈淋巴结分别送病理科行常规石蜡切片及HE染色组织学检查，比较两组的病理学状况。

图1 甲状腺乳头癌患者前哨淋巴结活检

2. SLN的技术标准：按照美国louisville大学SLNB（乳腺癌前哨淋巴结活检术）的标准分别计算两组SLN的检出率、准确率、假阴性率。（1）检出率 = SLN检出例数/实施SLN检测所有例数× 100﹪；（2）准确率= SLN真阳性和真阴性例数之和/SLN活检总例数×100﹪；（3）假阴性率= SLN假阴性例数 /淋巴结转移阳性例数×100﹪；（4）灵敏度= SLN转移阳性例数/淋巴结转移阳性例数× 100﹪。

三、统计学分析方法

应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，各组病例SLN平均检出枚数采用t检验，检出率比较采用c2检验，灵敏度、准确率、假阴性率比较采用fi sher确切概率法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组染色结果比较

术中成功游离的被亚甲蓝和纳米碳细胞染色示踪的SLN，如图1所示，同时可见用纳米碳示踪可获得更清晰的术野。HE染色显示SLN病理切片中，转移阳性和转移阴性细胞具有明显差异，转移呈阳性的淋巴组织背景下见细胞核增大拥挤、轮廓不规则毛玻璃样、可见核沟和核内假包涵体的被诊断是转移阳性SLN，转移呈阴性的见淋巴细胞核较小、轮廓清晰、染色均匀（图2）。

图2 光学显微镜下观察前哨淋巴结形态（HE染色）

表1 甲状腺癌患者前哨淋巴结转移位置及转移情况

二、亚甲蓝组检出率比较

亚甲蓝组65例中，检出SLN者52例，检出率为80﹪，其中检出1枚者13例，2枚者20例，3枚者10例，4枚6例，5枚者3例，共计122枚，平均检出（2.35±1.52）枚；SLN位于Ⅱ区5枚，Ⅲ区14枚，Ⅳ区34枚，Ⅴ区1枚，Ⅵ区68枚，SLN结检出率在Ⅳ区和Ⅵ区最多（83.61﹪），阳性率在Ⅳ区和Ⅵ区最高，较其他区域差异有统计学意义（c2= 8.122，P = 0.004，表1）；检出术中提示SLN阳性者27例，颈淋巴结阳性例数有32例，SLN阴性者25例，其中5例术后病检示颈淋巴结阳性，SLN活检灵敏率、准确率为、假阴性率及术后低钙抽搐发生率见表2。

表2 甲状腺癌患者亚甲蓝组及纳米碳组检出情况

三、纳米碳组检出率比较

纳米碳组65例中，检出SLN者61例，检出率为93.84﹪，其中检出1枚者10例，2枚者22例，3枚者16例，4枚者8例，5枚者5例，共计159枚，平均检出（2.61±1.81）枚；SLN位于Ⅱ区8枚，Ⅲ区20枚，Ⅳ区45枚，Ⅴ区4枚，Ⅵ区82枚，SLN检出率在Ⅳ区和Ⅵ区最多（79.87﹪），阳性率在Ⅳ区和Ⅵ区最高，较其他区域差异有统计学意义（c2= 11.069，P = 0.001，表1）；检出术中提示SLN阳性者30例，颈淋巴结阳性例数有33例，SLN阴性者31例，其中3例术后病检示颈淋巴结阳性。SLN活检灵敏率、准确率、假阴性率及术后低钙抽搐发生率见表2。

四、两组间检出情况对比

两组SLN检出率差异有统计学意义（P < 0.05），两组准确率、灵敏度、假阴性率、平均SLN检出枚数、术后低钙抽搐发生率比较差异无统计学意义（P > 0.05，表2）。

两组所检出的SLN在各区的分布情况差异无统计学意义（统计时因各组Ⅰ区Ⅴ区检出枚数均较小，将其与Ⅱ区合并计算，c2= 1.043、P = 0.791），两组均在Ⅳ区和Ⅵ区的检出率、阳性率最高，两组间差异无统计学意义（检出率：c2= 1.043，P = 0.425；阳性率：c2= 0.012，P = 0.914），两组合并分层分析见Ⅳ区和Ⅵ区的阳性率较其他区域高，差异有统计学意义（c2=19.150，P = 0.000）。

讨 论

甲状腺乳头状癌为甲状腺癌最常见类型，占甲状腺癌的88﹪，手术为其治疗的首选方案，因经淋巴细胞转移率高，较早即能出现颈部淋巴结转移[4]，所以手术便涉及淋巴结清扫的问题。因每个患者的淋巴结转移情况不同，致使手术中是否需行淋巴结清扫及清扫的范围也不同，由于术前的影像学检查无法准确诊断颈部淋巴结是否存在隐匿性转移，所以术中是否行选择性颈淋巴结清扫及清扫范围无统一意见[5-6]。

甲状腺乳头状癌是最为典型的亲淋巴型肿瘤，无论单侧或双侧癌都会首先并主要转移至局部淋巴结[7]，转移的第一站即是SLN，淋巴结转移跳跃较罕见，理论上，若SLN未发生转移，则其他淋巴结也不存在转移，故可根据SLN的检测结果来决定淋巴结清扫术实施与否。通过对SLN的细胞染色示踪可以发现病变淋巴细胞转移的路线，然后对发现的SLN进行活检，了解其病理状态，预测淋巴结转移存在与否，可决定合理的淋巴清扫范围，提高肿瘤根治的手术效果，同时避免盲目行侧颈淋巴结清扫，减少术后并发症并有效提高患者术后生活质量。

示踪SLN的方法主要有染色法、同位素法、染色与同位素联合法[8]。同位素法和联合法因甲状腺SLN距肿瘤很近，受到甲状腺肿瘤及甲状腺内同位素干扰大，且需特殊仪器，并具有放射性污染，其使用受到一定限制[6]。与同位素法和联合法相比，染料法更具有操作方便、直观简便、无毒副作用的优点。目前国内常见的染色法采用亚甲蓝染色，在SLN的检出中取得了一定的临床经验基础，证实了其方便宜行、易推广，但亚甲蓝易使周边组织一块蓝染，从而影响SLN的检出，致术中有可能出现盲目解剖并且容易误切甲状旁腺。本试验亚甲蓝组2例患者出现了术后低钙抽搐，发生率3.17﹪（2/63），纳米碳组未有患者出现术后低钙抽搐，发生率为0﹪（0/65），虽然结果差异无统计学意义（P > 0.05），但术中亚甲蓝污染邻近组织确实在行颈淋巴结清扫时，影响视觉感观，对手术有一定干扰，致使清扫时误伤甲状旁腺，纳米碳是否在甲状旁腺的保护上具有一定优势仍需要进一步临床大样本的研究来明确。

本实验亚甲蓝组SLN检出率80﹪（52/65），纳米碳组93.84﹪（61/65），两组SLN检出率差异具有统计学意义，可认为纳米碳的SLN检出率是高于亚甲蓝的，这也是纳米碳的特点所决定。纳米碳具有高度的淋巴细胞趋向性，其团粒直径平均为150 nm。注射到肿瘤局部组织后，纳米碳可迅速经淋巴管聚集于淋巴细胞，使淋巴结染成黑色，不进入毛细血管，避免了大量组织被染色，实现区域淋巴结的细胞示踪[9-10]。甲状旁腺负显影的作用在术中保护甲状旁腺更具有临床意义[11-12]。

虽然纳米碳在SLN检出率上具有优势，但两组在准确率、灵敏度、假阴性率、平均SLN检出枚数比较上差异无统计学意义（P均> 0.05），两组细胞示踪所检出的SLN在各区的分布情况差异无统计学意义（P > 0.05），两组均在Ⅳ区和Ⅵ区的检出率、阳性率最高，两组间差异无统计学意义（P均> 0.05）。可认为传统的亚甲蓝在淋巴结清扫术中并不是能被纳米碳所完全取代，亚甲蓝仍然具有可行性。本研究中，纳米碳及亚甲蓝对SLN的检测，均能反应颈部淋巴结的情况，对甲状腺乳头状癌是否进行颈部淋巴结清扫具有指导意义。纳米碳相比亚甲蓝术区视野较干净清晰，且SLN检出率高，值得推广。

综上所述，因两组的灵敏度比较高，笔者认为若术中快速病检示SLN为阳性时，建议常规行区域性颈淋巴结清扫，本研究两组均在Ⅳ区和Ⅵ区的SLN检出率、阳性率最高，两组合并分层分析见Ⅳ区和Ⅵ区SLN检出率较其他区域高，差异有统计学意义（P < 0.05），这与国内甲状腺癌研究的结果相符。所以术中快速病检发现Ⅳ区和Ⅵ区有颈淋巴结阳性时，建议做重点清扫，目前普遍认为Ⅵ区（中央区）是甲状腺乳头状癌转移的SLN，本试验两组在此区检出SLN枚数及阳性枚数最多，检出率、转移率均较高，更应是清扫范围的重中之重，2006年美国甲状腺协会颁布指南，建议甲状腺乳头状癌患者常规清扫中央区淋巴结[13-14]，国内亦对cN0甲状腺乳头状癌患者主张初始手术常规清扫中央区淋巴结[15]。

但同时两组都存在着一定的假阴率，所以若术中发现SLN为阴性时，是否行区域性颈淋巴结清扫仍需根据患者年龄、身体情况、术前影像学检查、肿瘤是否侵及包膜等情况来综合考虑。对于肿瘤侵及包膜者，有学者主张预防性中央区颈淋巴结清扫[16]，若此时SLN不在中央区，笔者建议除了中央区外还需行SLN所在区域淋巴结清扫。

1 Cabanas RM. An approach for the treatment of penile carcinoma[J]. Cancer, 1977, 39(2):456-466.

2 双羽, 李超, 黄永望. 前哨淋巴结检测在头颈部肿瘤中的研究进展[J]. 中国眼耳鼻喉科杂志, 2015, 15(1):61-64.

3 Hao RT, Chen J, Zhao LH, et al. Sentinel lymph node biopsy using Carbon nanoparticles for Chinese patients with papillary thyroid microcarcinoma[J]. Eur J Surg Oncol, 2012, 38(8):718-724.

4 吴在德, 吴肇汉, 郑树, 等. 外科学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 313-316.

5 江国斌, 方红燕, 蔡建明. 纳米碳混悬液示踪前哨淋巴结在甲状腺乳头状癌中的应用[J]. 中国癌症杂志, 2010, 20(12):939-940.

6 贾中明, 刘艳, 黄秋林. 纳米碳定位前哨淋巴结在cN0甲状腺乳头状癌中的临床研究[J]. 临床合理用药, 2011, 4(9):9-10.

7 胡家永, 张海威, 周永华, 等. Ⅵ区淋巴结清扫治疗cN0期甲状腺乳头状癌38例临床分析[J]. 中华内分泌外科杂志, 2013, 7(1):8-10.

8 蔡蕾, 华清泉. 前哨淋巴结检测在甲状腺癌中的应用[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2013, 27(4):222-224.

9 Asín L, Ibarra MR, Tres A, et al. Controlled cell death by magnetic hyperthermia: effects of exposure time, field amplitude, and nanoparticle concentration[J]. Pharm Res, 2012, 29(5):1319-1327.

10 Madru R, Kjellman P, Olsson F, et al.99mTc-labeled superparamagnetic Iron oxide nanoparticles for multimodality SPECT/MRI of sentinel lymph nodes[J]. J Nucl Med, 2012, 53(3):459-463.

11 邓维叶, 李浩, 陈艳峰, 等. 纳米碳混悬液在甲状腺乳头状癌术中应用的研究[J/CD]. 中华普通外科学文献:电子版, 2014, 8(6):451-455.

12 朱精强, 汪洵理, 魏涛, 等. 纳米碳甲状旁腺负显影辨认保护技术在甲状腺癌手术中的应用[J]. 中国普外基础与临床杂志, 2013, 20(9):992-994.

13 Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, et al. Management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer[J]. Thyroid, 2006, 16(2):109-142.

14 郑雅娟, 袁宏钧, 仲妙春, 等. 分化型甲状腺癌颈部淋巴结转移相关因素分析[J]. 浙江医学, 2013, 35(5):361-363.

15 吴毅.《甲状腺结节和分化型甲状腺癌临床诊治指南》热点解读[J].中华内分泌外科杂志, 2012, 6(1):1-2.

16 潘利, 朱理玮, 李斌辉, 等. 中央区淋巴结清扫术治疗cN0期甲状腺乳头状癌的可行性分析[J]. 天津医科大学学报, 2010, 16(4):619-621.

Comparison between carbon nanoparticles and methylene blue on cell tracking of sentinel lymph node for papillary thyroid carcinoma

Chen Jie, Zhou Xiaohong, Li Zhenhua, Ge Jiahua, He Yun, Zhang Yulian. Chongqing Cancer Reserch Institute, Chongqing 400030, China

Zhou Xiaohong, Email:996294274@qq.com

Objective To evaluate the value of methylene blue and carbon nanoparticles as cell tracer in the sentinel lymph node（SLN）for papillary thyroid carcinoma. Methods 130 patients with papillary thyroid carcinoma were enrolled in the study. The patients were divided into two groups randomly, which were given sentinel lymph node biopsy with either methylene blue or carbon nanoparticles. The sentinel lymph node location and number were recorded, followed by ipsilateral functional cervix lymph node dissection. Then the sentinel lymph node and dissected cervix lymph nodes were subject to pathology examination respectively. Experimental data were statistically analyzed by t test，chi-square test and fisher exact probability test when appropriate. Results In 65 patients in the methylene blue group, SLN were identified in 52 patients, with 27 having histopathologically positive lymph nodes. The detection rate, sensitivity, accuracy rate and false negative rate were 80﹪, 84.38﹪, 90.38﹪, and 15.62﹪, respectively. Whereas in the carbon nanoparticles group, SLN were identified in 61 patients, with 30 having histopathologically positive lymph nodes.The detection rate, sensitivity, accuracy rate and false negative rate were 93.84﹪ , 90.91﹪, 95.08﹪, and 9.09﹪, respectively.The difference of the detection rate was significant（c2= 5.482，P = 0.019）. There was no significantly difference on the distribution of the detected SLN in regions between the two groups（c2= 1.043, P = 0.791）.The detection rate and positive rate of SLNwere both highest in region Ⅳand Ⅵ in the two groups.And there was no significantly difference between the two groups（c2= 1.043，P = 0.425 ；c2= 0.012，P = 0.914）. Conclutions Methylene blue and cabon nanoparticles are both feasible in intraoperative SLN identification. They could reflect lymphatic metastasis accurately and be instructive to cervix lymph nodes dissection. Carbon nanoparticles tracer provides clearer surgery field and has higher detection rate.

Thyroid neoplasms； Sentinel lymph node； Nanostructures；Carbon； Methylene blue； Cell tracking

2016-07-11）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.002

400030 重庆市肿瘤研究所

周晓红，Email：996294274@qq.com

陈杰，周晓红，李真华，等. 利用纳米碳与亚甲蓝示踪甲状腺乳头状癌前哨淋巴结的对比研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版）, 2017, 7(1):7-11.