儿童结核病诊断技术新进展及展望

刘珍敏 许红梅

重庆医科大学附属儿童医院（重庆 400014）

儿童结核病诊断技术新进展及展望

刘珍敏 许红梅

重庆医科大学附属儿童医院（重庆 400014）

在发达国家，结核病多发生在中老年人群中，而在发展中国家则多发生在儿童。据世界卫生组织全球结核病报告，2014年全球结核病患者新增960万例，其中儿童结核病新增100万例[1]。中国作为全球22个结核病高负担国家之一，结核病的发病率和病死率均非常高。儿童处于生长发育阶段，免疫功能尚未成熟，暴露后更易受到结核菌感染，且年龄越小，发病率越高、病情越重。长久以来，儿童结核病临床表现及影像学检查不典型，传统的结核分枝杆菌抗酸染色涂片和培养技术、结核菌素试验（tuberculin skin test ,TST）的阳性率低而致诊断困难。近年来，结核病的诊断成为了备受关注的焦点。得利于科技的发展，结核的诊断技术有了很大进步，同时也涌现出了不少新的检查方法。

1 影像学诊断技术

X线平片在临床上的应用广泛，可以确定肺部病变的范围、性质与类型，对多数肺结核可以诊断。一般来说，原发综合征多显示为肺内片状浸润影，病灶多发生在上叶尖后段和下叶背段；而多形性则是诊断浸润性肺结核的重要影像学依据，比如斑片状浸润、空洞、结节、球形等。但在实际工作中，因小儿肺结核临床表现不典型，且X线表现多样，特别容易将片状或带状浸润阴影的影像表现误诊为肺炎[2]。CT对于结核的诊断价值优于胸部X线平片，能更为敏感地显示出肺门淋巴结肿大，有助于发现肺门及纵隔肿大淋巴结或结核增殖灶和常规X线片不易发现的隐匿病灶、早期空洞病变及早期粟粒影[3]。此外，脊柱结核的诊断方面，磁共振成像(MRI)在显示椎间盘破坏、狭窄、消失和脊髓及硬膜囊受压等软组织的改变两个方面具有明显优势[4,5]。也有研究指出，超声检查在儿童早期骨关节结核的诊断中有重要辅助作用，即对于有局部关节疼痛、活动受限及伴或不伴低热的患儿，若超声检查示干骺端骨质破坏、软组织脓肿及死骨形成，或有血流信号、关节积液及骨膜抬高，应考虑骨结核可能[6]。

2 微生物学检测技术

2.1 传统结核分枝杆菌涂片及培养

石炭酸复红抗酸染色（Ziehl-Neelsen染色）作为传统结核分枝杆菌涂片的染色方法，一直被临床广泛使用，具有快速、简便且价廉的特点，为世界卫生组织（WHO）推荐的检测结核分枝杆菌确诊结核菌感染的方法。但其灵敏度和特异度较差，不但对细菌的数量要求较高，且无法辨别死菌与活菌，也容易受到制片质量的影响。

结核分枝杆菌培养是结核分枝杆菌检测和药敏试验的金标准，其灵敏度高于涂片，且能够区分死菌与活菌，但传统的罗氏培养法耗时较长，并不利于临床的快速诊断。最近，具有对结核分枝杆菌生长连续监测的自动液体培养系统（如BD BACTEC MGIT系统）较传统罗氏固体培养技术有显著改进[7]。来自成人的研究显示，自动液体培养系统的检测增加了灵敏度，减少了检测时间，后续还可做药敏实验[8,9]。虽然目前还缺乏儿科的数据，但将其推广到儿童结核病的诊断是值得期待的。

2.2 发光二极管荧光显微镜

发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）及检测技术因其结合了 LED 光源与荧光显微镜，而具有镜光柔和、光度纯和干扰少等特点，且其检测环境不受限制，使用寿命长，价格也相对低廉。WHO于2011年提出LED荧光显微镜逐步取代传统的荧光显微镜，作为以光学显微镜检测方法[10]。有研究表明，LED荧光显微镜比传统光学显微镜涂片阳性率高出1.15%，且两种镜检方法的检出率差异有统计学意义，而特异度几乎相当[11]。另外，使用LED荧光显微镜对人员的学历背景及工作经验要求较低，只需通过培训并熟练掌握之后即可开展检测工作，故其在基层医疗机构有较大的推广价值。

3 免疫学诊断技术

3.1 结核菌素皮试试验（TST）

TST是由澳大利亚科学家发明的一个检测方法，它以结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative ,PPD) 为抗原，经注射并刺激宿主引起迟发型超敏反应，使其局部出现皮肤硬结，根据硬结的平均直径来反应结核菌感染情况，是临床常规检测之一。虽然其具有简便、价廉的特点，但若机体免疫力低下可出现假阴性，使灵敏度降低[12]。另外，由于结核菌素试验使用的抗原是结核分枝杆菌和卡介苗菌株共同的抗原，也可使正常机体发生迟发型变态反应而导致假阳性，影响特异度[13]。

3.2 结核感染T细胞斑点试验

结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）使用特异性抗原（ESAT-6/CFP-10）来刺激机体，使其释放大量γ-干扰素[14]，取全血并提取单核细胞，经酶联显色后对斑点进行计数，从而判断是否有结核杆菌感染。其提取的抗原由位于结核杆菌RD1区的相同操纵子所编码，卡介苗（Bacillus Calmette Guérin ,BCG）均丢失该基因序列，且BCG 菌株和绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区，故该项检测方法不受环境分枝杆菌及BCG接种影响，在一定程度上可以避免假阳性[15,16]。有相关文献报道，T-SPOT.TB具有较高的灵敏度（80%～90%）及特异度（90%～98%）[17-19]。针对儿童结核病患者留痰困难，其血液标本方便采集，具有较快的检测速度（24 h即可出结果）而逐渐被广泛使用。除了抽取外周血进行T-SPOT.TB检测之外，若其他标本（如脑脊液、胸水、腹水）有足够的淋巴T细胞亦可用于检测，这有利于肺外结核病的诊断。另外，在结核病患者抗结核的治疗过程中，T-SPOT.TB在一定程度上有监测疗效的作用，若抗结核治疗有效，则T-SPOT.TB的斑点数会减少，部分患者T-SPOT.TB甚至可能转阴。但T-SPOT.TB 检测也有局限性，因为其原理是人体对结核分枝特异性抗原的免疫反应（而并非细菌本身），阳性结果仅代表患者体内存在被结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞，故并不能区分患者是活动性结核感染、既往感染还是潜伏性感染的状态[20]。

3.3 其他诊断方法

有研究在成人中证实结核特异性T细胞CD27分子的改变可以区分结核病的活动性与潜伏性，结核特异性T细胞CD27表达的丧失与结核抗原持续刺激和迁移至病灶有关。瑞士的研究者Portevin等[21]在来自坦桑尼亚的儿童中对这个推测进行了研究，同时收集患儿的痰与外周血标本，分别用于结核分枝杆菌培养和分离单个核细胞后进行结核特异性抗原刺激，以进行结核 T 细胞活化标志物（TAM-TB）的研究。TAM-TB 分析测定结核特异性 T 细胞表面 CD27 分子的荧光强度，计算丢失表面 CD27 分子的结核特异性 T 细胞与所有结核特异性细胞的比值从而进行诊断。结果显示该诊断方法的灵敏度为83.3%，特异度为96.8%。但目前用于TAM-TB诊断的临界值来成人的研究，儿童相关研究很少，该项检测方法是否适于儿童还需有更大的样本进行验证。

4 分子生物学诊断技术

Xpert MTB／RIF是由美国 Cepheid 开发的结核分枝杆菌检测试剂盒，以半巢式实时荧光定量 PCR技术为基础，能够将样本的准备、扩增、检测集于一体[22]，已被世界卫生组织推荐用于儿童结核病的诊断。该技术不仅能在2 h内从患儿新鲜痰液中直接检出是否含有结核分枝杆菌，还可通过检测rpoB基因突变情况确认是否存在利福平耐药。该技术采用6 种分子信标同时对6 种探针进行检测，其中有5种探针通过选择性覆盖rpoB基因利福平耐药决定区进行耐药检测，另外1种探针作为内对照进行质控。该技术只需将痰标本处理后放入到反应试剂盒中，系统会自动进行检测。试验中基本不产生气溶胶，极大程度地减少了操作中污染的可能性。由于Xpert MTB/RIF系统对于细菌量有一定要求，因此相对痰涂片阴性的标本，痰涂片阳性标本的灵敏度相对较高。但由于该试剂盒的价格昂贵，提高了检测成本，故不利于临床的推广应用。

5 芯片技术

5.1 蛋白芯片技术

结核生物蛋白芯片技术的原理是利用微阵技术，将结核菌的三种抗原即纯化的脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan ,LAM）、结核分枝杆菌蛋白16 kD及38 kD固相在同一膜片上，加入待检血清后，利用微孔滤膜的浓缩、凝集及渗滤作用，在固相膜上进行快速的抗原抗体反应，使用免疫金作为标志物直接在膜上进行显色，通过对LAM、16 kD及38 kD三种特异性结核抗体进行同步检测，做出对结核分枝杆菌感染情况的分析判断[23]。结核蛋白芯片技术相较于传统方法，具有简便、灵敏度高、检测迅速的特点。蛋白芯片检测具有高通量的特性，一次实验便可提供大量的信息，用于全面地研究蛋白表达谱；并且灵敏度较高，可以检测出蛋白样品中存在的微量蛋白；检测速度也较快，只需几分钟就可以得到结果；另外，由于采用芯片识别阅读仪判读结果，可避免人为阅读的主观误差。有研究发现，将蛋白芯片检测阳性的诊断标准确定为联合多项抗体阳性时，可大幅度提高检测的特异度[24]。但是IgG抗体的产生受机体免疫状态、结核分枝杆菌的数量等因素影响较大，如曾经感染过结核的患者，IgG抗体往往也会是阳性，不可避免的假阳性导致过度诊断。

5.2 基因芯片技术

基因芯片即DNA微阵列的原理是在微型载体上按微阵列的方式固定寡核苷酸，与带标记的待测DNA或mRNA杂交，据产生信号强弱来判断靶DNA或mRNA中与芯片相应基因的变异或表达。目前，基因芯片技术用于检测成人结核病有良好的效果，也有儿童结核病使用基因芯片技术诊断的报道。有报道分别对结核病患儿与非结核病患儿进行了结核杆菌抗酸染色涂片、结核分枝杆菌培养以及结核杆菌DNA微阵列芯片检测比较，其发现DNA微阵列芯片检测结核病患儿分枝杆菌的灵敏度（24.3%）略高于结核抗酸杆菌涂片(17.2%)及结核分枝杆菌培养(20.0%)[25]。基因芯片技术能在支持物上同时固定大量探针，因而只须一次杂交便可获得大量信息。还可做耐药相关研究，有报道称基因芯片法和罗氏培养法在判断是否存在异烟肼耐药方面的差异无统计学意义[26]。但是基因芯片技术所需的设备昂贵，检测费用高，所以临床上并不常规使用。

综上所述，在诊断儿童结核病时，由于取得细菌学诊断依据较难，亟需快速、简便、准确的诊断技术。随着近些年的新技术的出现，多种有潜力的新诊断方法被开发并逐步在临床应用。各种方法各有优劣，对儿童结核病的诊断还需结合临床表现及多种检查方法，取长补短，进行综合诊断。相信在不久的将来，在通过对新技术的合理运用后，结核病的诊断不再如此艰难，对儿童结核疫情的控制起到有利的作用。

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10.3969/j.issn.1000-3606.2017.11.019

2017-04-10)
(本文编辑：邹 强)