辛伐他汀减轻蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的机制研究

李 杨，石伏军，张 健

蛛网膜下腔出血(SAH)是严重危及生命的常见脑血管意外，10%～15%的卒中患者在入院前死于SAH[1]。脑血管痉挛(CVS)作为SAH常见而危险的并发症，是SAH后致死致残的主要原因，一旦发生，难以逆转[2]。研究表明，在CVS的病理生理过程中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、IL-8、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)参与血管内皮细胞的损伤[3]。辛伐他汀是临床常用的调脂药物，研究发现其可预防 SAH后迟发性 CVS发生，但其机制还未明确[4]。本研究以免SAH模型为基础，探讨辛伐他汀对兔SAH后迟发性脑血管痉挛期血管内皮细胞TNF-α、IL-6、IL-8和eNOS水平的影响，明确辛伐他汀预防SAH后迟发性CVS的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，超敏二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司)，β-actin(Invitrogen公司)，全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技公司)，过硫酸铵(GIBICO公司)，IL-6试剂盒(南京建成生物工程研究所)，IL-8试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验分组及模型建立：健康成年雄性新西兰大白兔36只，体重2 200～3 200 g，购于宁夏医科大学实验动物中心。随机分为3组：①SAH组(SAH)，常规饲养，从枕骨大孔处穿刺进入蛛网膜下腔，注入自体动脉血 1 mL/kg建立蛛网膜下腔出血模型，48 h后以相同方式再次注血；②SAH+辛伐他汀组(SAH+ SVT组)，常规饲养，连续7 d每天给予辛伐他汀 5 mg/kg胃灌，后与SAH组以相同方式处理；③假手术组(Sham组)，常规饲养，于相同时间点给予等量生理盐水。

1.3 标本采集：常规麻醉开胸，经主动脉灌注生理盐水 (37 ℃) 300 mL和4%多聚甲醛200 mL。取新鲜基底动脉及周围脑干组织置于冰生理盐水，立体显微镜下分离基底动脉，生理盐水冲洗血管内残留血液，将标本置于液氮中2 min，再放入-70 ℃冰箱保存备用。

1.4 免疫组织化学法：石蜡切片常规脱蜡至水，采用SP法，高压修复抗原8 min，后续按二抗试剂盒和DAB显色试剂盒说明书步骤操作。苏木素复染，梯度脱水，中性树胶封片。

1.5 Western blot法：按蛋白提取试剂盒说明提取兔基底动脉组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影后将X线片扫描入凝胶成像系统进行灰度值分析。

2 结果

2.1 辛伐他汀对基底动脉壁TNF-α表达的影响:采用免疫组化法检测基底动脉壁TNF-α表达变化，结果显示，SAH+SVT组基底动脉痉挛减轻，与SAH组相比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1-图4(目录后)，TNF-α表达明显降低；SAH+SVT组与Sham组TNF-α表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 辛伐他汀对基底动脉壁IL-6和IL-8水平的影响：采用ELISA法检测基底动脉壁IL-6和IL-8水平，结果显示，与SAH组相比较差异有统计学意义(P<0.05)；SAH+SVT组基底动脉壁IL-6和IL-8水平均明显降低。SAH+SVT组与Sham组IL-6和IL-8水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 辛伐他汀对基底动脉壁eNOS表达的影响：采用Western blot法检测基底动脉壁eNOS蛋白表达变化，结果显示，与SAH组相比较差异有统计学意义(P<0.05)；SAH+SVT组基底动脉壁eNOS蛋白表达明显降低。SAH+SVT组与Sham组eNOS蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

CVS是SAH最常见且严重的并发症，常见于蛛网膜下腔中较大的动脉强烈收缩，是动脉瘤破裂死亡的主要原因之一[5]。据统计，在所有SAH病例中高达50%是致命性的，而存活的患者常伴随神经系统或认知障碍。CVS发病机制复杂，有研究证实，炎症反应可能在其发展过程中发挥重要作用[6]。

目前研究表明，CVS是由于血管舒张与收缩平衡失调所致，其中eNOS是调控血管功能的关键酶，其介导内皮依赖性血管舒张反应下降并在炎症反应中发挥重要作用，有实验证实，一氧化氮(NO)替代治疗可逆转CVS[7- 8]。实验表明，SAH后eNOS mRNA和eNOS蛋白水平均下降，SAH大鼠的体外实验表明内皮功能障碍与eNOS蛋白的表达下降有关[9]。此外，大量实验和临床证据提示，炎症反应参与了SAH后CVS的发生和发展。在SAH尸检和犬SAH模型中，可见基底动脉内膜、中膜及蛛网膜下腔内嗜中性粒细胞、巨噬细胞浸润，且SAH后炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等表达水平明显增加。同时Wu Wei等的研究表明，脑动脉周围的严重炎症可导致中至重度的持续CVS[10]。Clatterbuck等研究发现，给猴SAH模型静脉应用抗CDll/CD18单克隆抗体可明显降低CVS的发生[11]。TNF-α是机体参与炎症和免疫应答反应的重要因子，其诱导内皮细胞和白细胞产生黏附分子，增强后者对毛细血管内皮的黏附力，引起白细胞脱颗粒释放自由基、蛋白酶和毒性代谢产物，诱发级联反应，从而损伤炎症区域细胞[12-13]。有研究证实，TNF-α在急性SAH的病理生理过程中参与了这种损伤作用，且TNF-α水平变化与患者基底动脉血流量变化在时间和程度上相一致[14]。辛伐他汀能抑制内源性胆固醇合成，目前临床上已被广泛用于治疗高脂血症。随着他汀类新药的不断开发，其抗炎、抗氧化、抑制血管平滑肌细胞增殖及调节内皮细胞功能等作用也越来越被国内外学者关注和认可[15]。因此，辛伐他汀可能是通过抑制炎性因子表达，减轻SAH后血管局部炎症反应，从而缓解CVS。

本研究显示，辛伐他汀能够减轻基底动脉痉挛，下调TNF-α和eNOS蛋白表达，同时降低IL-6和IL-8水平，这进一步证实辛伐他汀可通过抑制炎性细胞因子表达，降低 SAH 后血管壁局部的炎症反应，减少组织损伤，维持血管正常功能，缓解CVS，其更为详细的作用机制有待我们进一步研究。

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