响应面法优化白花菜中黄酮类化合物的提取研究

王 菲， 山显彤， 张家境， 王战勇

(辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001)

响应面法优化白花菜中黄酮类化合物的提取研究

王 菲， 山显彤， 张家境， 王战勇

(辽宁石油化工大学 化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001)

采用超声波辅助溶剂浸提法提取白花菜中的黄酮化合物，通过响应面法优化最佳提取条件。考察单因素(乙醇体积分数、液固比、超声功率、超声时间、水浴温度、水浴时间和提取次数)对白花菜黄酮得率的影响，在此基础上，进行Box-Behnken响应面优化试验，分析并确定了最佳提取条件：乙醇体积分数65%、液固比(mL/g)32∶1、超声功率30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min、提取次数1次。在最佳提取条件下，白花菜黄酮的实际得率为1.974 5 mg/g，与预期值十分接近。

白花菜； 黄酮类化合物； 提取； 响应面法

花菜俗称菜花，有白、绿两种，白色的叫白花菜，是由甘蓝演化而来，在《时代》杂志推荐的十大健康食品中位列第四名[1]。花菜是含有类黄酮较多的食物之一。花菜性平味甘，对视力衰弱、肥胖、水肿以及预防动脉硬化都有疗效，还具有开音止咳、清热、利尿之功效。而生物类黄酮具有广泛的生物活性作用，比如抗氧化、抗衰老、抗菌、抗辐射、抗肿瘤、抗白血病、降血脂、免疫调节等[2-4]。现今有些黄酮类成分已正式投入药物生产，如槲皮素片、黄芩苷片和银杏叶制剂等，所以提取具有较高生物活性的黄酮类化合物越来越重要。提取黄酮的传统方法有浸提法、索氏提取法和回流法等，近年来在提取工艺方面出现了酶法提取、微波提取以及超声提取等新方法[5-10]。本实验采用超声波辅助溶剂浸提法，利用超声波的空化作用加速细胞壁的破碎，促使细胞胞内黄酮的尽快溶出，大大缩短提取时间[11-12]，并通过单因素考察结合响应面法对白花菜黄酮的提取工艺进行优化。

1 实验部分

1.1 实验原料及药品

实验原料：白花菜，购于抚顺。

实验药品：硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠，以上试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂沈阳公司；芦丁：100 g，分析纯，购于合肥博美生物科技有限公司。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 白花菜中黄酮类化合物的提取方法 精确称取1.00 g干燥后的白花菜，用粉碎机将其粉碎，制成粉末样品。将粉末样品与乙醇溶液按设计的体积分数30%～100%和液固比(mL/g)10∶1～50∶1混合，在超声功率10～50 W下超声3～8 min，并在30～80 ℃水浴温度下提取20～120 min，提取完成后将混合溶液在3 500 r/min台式离心机下离心10 min，收集上清液，得到白花菜黄酮样品。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[13-16]，用分光光度计在510 nm波长处测定其吸光度，计算黄酮得率。

1.2.2 白花菜中黄酮得率的计算 黄酮得率的计算公式如下：

1.2.3 提取工艺最优参数的确定 在单因素实验中，考察乙醇体积分数、液固比、超声功率、超声时间、水浴温度、水浴时间以及提取次数，对白花菜黄酮得率的影响，并在单因素实验的基础之上，采用Box-Behnken响应面法来优化确定白花菜黄酮的最佳提取工艺条件。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对白花菜黄酮得率的影响

称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在液固比(mL/g)20∶1、超声功率30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min的条件下，考察乙醇体积分数对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图1。

图1 乙醇体积分数对白花菜黄酮得率的影响

乙醇体积分数是影响提取效果的一个主要因素，一般情况下随乙醇体积分数升高得率也会升高，但由图1可以看出，白花菜黄酮的得率在乙醇体积分数30%～60%时呈直线上升，在乙醇体积分数60%～100%时，白花菜黄酮的得率逐渐减少，这是因为相似相溶原理，乙醇体积分数过高会溶出其他一些成分，因此，乙醇体积分数选定在50%～70%。

2.1.2 液固比对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、超声功率30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min的条件下，考察液固比对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图2。

图2 液固比对白花菜黄酮得率的影响

从图2中可以看出，白花菜黄酮的得率随液固比的增大先是大幅提高而后小幅度降低，当液固比(mL/g)为35∶1时，黄酮的得率达到峰值，当液固比(mL/g)大于35∶1时，白花菜黄酮的得率有所降低。考虑到增加乙醇溶液的体积会增加生产中的操作费用，故选择液固比(mL/g)为30∶1～40∶1。

2.1.3 超声时间对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、液固比(mL/g)20∶1、超声功率30 W、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min的条件下，考察超声时间对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图3。

图3 超声时间对白花菜黄酮得率的影响

从图3中可以看出，白花菜黄酮得率在超声时间3～5 min逐渐增加，当超声时间5～8 min时，白花菜黄酮得率逐渐减少。因为延长超声时间会增加能源的消耗，使生产周期延长，增加操作费用，所以超声时间选定4～6 min。

2.1.4 超声功率对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、液固比(mL/g)20∶1、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min的条件下，考察超声功率对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图4。

图4 超声功率对白花菜黄酮得率的影响

从图4中可以看出，超声功率对白花菜黄酮得率的影响不大，所以从节约能耗、提高效率的角度考虑，确定超声功率为30 W。

2.1.5 水浴时间对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、液固比(mL/g)20∶1、超声功率为30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃的条件下，考察水浴时间对白花菜黄酮得率的影响，结果见图5。

图5 水浴时间对白花菜黄酮得率的影响

从图5中可以看出，白花菜黄酮的得率基本不受水浴时间影响，因此，根据实验水浴时间对白花菜黄酮得率的影响结果及其他因素的综合考虑，选定水浴时间40 min。

2.1.6 水浴温度对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、液固比(mL/g)20∶1、超声功率为30 W、超声时间5 min、水浴时间40 min的条件下，考察水浴温度对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图6。

图6 水浴温度对白花菜黄酮得率的影响

从图6 中可以看出，水浴温度对白花菜黄酮的得率的影响不显著。因此，根据本实验水浴温度对白花菜黄酮得率的影响及其他因素的综合考虑，选定水浴温度为50 ℃。

2.1.7 提取次数对白花菜黄酮得率的影响 称取1.00 g干燥后的白花菜粉末，在乙醇体积分数50%、液固比(mL/g)20∶1、超声功率为30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min的条件下，离心得到上清液，将得到的滤渣再重复提取3次，考察提取次数对白花菜黄酮得率的影响，实验结果见图7。

图7 提取次数对白花菜黄酮得率的影响

从图7中 可以看出，提取1次已将绝大部分黄酮提取出来，在第2次、第3次、第4次提取中，黄酮得率增加幅度比较小。考虑到提取次数增加会延长生产周期、增加生产成本，故以1次提取次数为宜。

通过以上单因素实验确定，当乙醇体积分数50%～70%、液固比(mL/g)30∶1～40∶1、超声时间4～6 min、超声功率30 W、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min、提取次数1次时，白花菜黄酮的得率较高。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken的中心组合设计原理，结合单因素实验结果，设计三因素三水平的响应面优化实验，对影响白花菜黄酮的提取条件进行进一步优化，从而获得提取白花菜黄酮的最佳提取条件，实验设计及结果见表1。

表1 实验设计及结果

续表1

根据对3个变量中心复合设计后所测得的在一定实验条件下白花菜黄酮得率的实验结果，并对实验数据进行多元回归分析，得到响应变量和实验变量的关系，如下列二元多次方程所示：

Y=2.06+0.22A+0.20B-0.005 250C- 0.096AB-0.048AC-0.064BC- 0.48A2-0.27B2-0.32C2

R2=0.952 0

响应面二次模型的方差分析结果如表2所示。

表2 响应面二次模型的方差分析结果

由表2可知，在本实验所涉及范围内，该模型P值为0.000 8，小于0.01，极显著。该模型决定系数R2=0.952 0，说明该模型与实际实验拟合良好，误差小，证明应用响应面优化法得到的提取条件提取白花菜黄酮是可行的。失拟项的P值是0.129 4，大于0.05，不显著，说明该方程拟合不足，检验不显著，无其他因素显著影响本试验。从表2中可以看出，因素A即乙醇体积分数，对白花菜黄酮得率影响最为显著(P<0.05)，因素B即液固比，对白花菜黄酮得率影响也很显著(P<0.05)。

2.2.2 响应面分析 根据回归分析结果做出响应曲面图和等高线图，以判断3个因素对黄酮得率的影响，进而推测出自变量与因变量二者之间的关系，结果见图8—10。

(a) 响应面3D图

(b) 等高线图

如图8所示，当超声时间一定时，液固比保持不变，随乙醇体积分数的升高，白花菜黄酮得率增加，当乙醇体积分数达到一定值时，黄酮得率又有所降低；乙醇体积分数不变，随液固比的增长，白花菜黄酮得率缓慢上升至稳定。由此可以推断出，在超声时间一定的条件下，适当范围内的增加乙醇体积分数和液固比有助于提高黄酮得率。

(a) 响应面3D图

(b) 等高线图

如图9所示，当液固比一定时，保持超声时间不变而增加乙醇体积分数，白花菜黄酮的得率呈上升趋势，当乙醇体积分数增加到一定值时，随超声时间增加黄酮得率降低；保持超声时间不变而增加乙醇体积分数，白花菜黄酮的得率逐渐增加，到达一定值后黄酮得率逐渐降低。由此表明，在液固比一定的情况下，适当范围内的乙醇体积分数和超声时间有利于黄酮的提取。

(a) 响应面3D图

(b) 等高线图

如图10所示，当乙醇体积分数一定时，液固比不变，随超声时间的增加，黄酮得率增加，但超声时间增加到一定值时，黄酮得率有所降低。超声时间不变时，白花菜黄酮得率随液固比的增加而升高至稳定。

根据响应面分析软件的预测，得到白花菜黄酮的最佳提取条件为：乙醇体积分数64.27%、液固比(mL/g)32.30∶1、超声时间4.90 min，黄酮得率理论预测值为1.922 4 mg/g。为检验试验结果是否与实际一致，按照以上试验结果进行验证试验。考虑到实际操作的便利，将提取条件修正为：乙醇体积分数65%、液固比(mL/g)32∶1、超声时间5 min。在此条件下进行3次平行试验，得到白花菜黄酮实际平均得率为1.974 5 mg/g，与理论预测值相接近，可见该模型能较好地模拟和预测试验中黄酮的得率。

3 结 论

采用超声辅助溶剂浸提法结合单因素和响应面优化实验，提取白花菜黄酮的最佳提取条件为：乙醇体积分数65%、液固比(mL/g)32∶1、超声功率为30 W、超声时间5 min、水浴温度50 ℃、水浴时间40 min、提取次数1次。通过响应面优化法得到的提取条件准确、可靠，具有实际应用价值。

[1] Lyimo M, Temu R P C, Mugula J K. Identification and nutrient composition of indigenous vegetables of Tanzania[J]. Plant Foods for Human Nutrition (Dordrecht, Netherlands), 2003, 58(1)：85.

[2] 王慧. 黄酮类化合物生物活性的研究进展[J]. 食品与药品, 2010,12(9)：347-349.

[3] 董彩军，李锋. 黄酮类化合物的研究进展[J]. 农产品加工·学刊, 2010, 27(2)：65-68.

[4] Bimakr M, Rahman R A, Ganjloo A, et a1. Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid compounds from spearmint (Mentha spicata L.) leaves by using response surface methodology[J]. Food Bioprocess Technol., 2012, 5(3):912-920.

[5] You Jingyan, Zhang Huarong, Ding Lan, et a1. Dynamic microwave-assisted extraction of flavonoids from radix scutellariae[J].Chem. Res. Chneseu., 2007,23(2):148-153.

[6] Maran J P, Manikandan S, Priya B, et al. Box-Behnken design based multi-response analysis and optimization of supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid compounds from tea (Camellia sinensis L.) leaves[J]. Food Sci. Technol., 2015, 52(1):92-104.

[7] 刘亚娟,范文昌. 微波提取苦瓜总黄酮的工艺研究[J]. 化学与生物工程, 2013, 30(10)：54-55.

[8] 冯颖. 无梗五加果多糖与黄酮化合物的提取纯化及生物活性研究[D]. 沈阳：沈阳农业大学, 2006.

[9] 徐国梅,谢梅. 花生壳中黄酮的超声波辅助提取工艺研究[J].应用化工, 2012, 41(10)：1707-1709.

[10] 赵二劳,段晋峰. 分光光度法测定黄花菜中总黄酮[J]. 分析试验室, 2008, 27(9)：94-96.

[11] 许效群,刘志芳,田夏,等. 超声波辅助提取苦荞米糠总黄酮[J]. 中国食品学报, 2014,14(6)：104-109.

[12] 王长春, 林向阳, 叶南慧,等. Plackett-Burman设计和响应面分析法优化枇杷叶中总黄酮的超声波提取工艺[J]. 中国食品学报, 2013, 13(3)：84-91.

[13] 王庆明，张金生，李丽华，等. 微波萃取-分光光度法测定党参中黄酮的研究[J]. 辽宁石油化工大学学报, 2010, 30(2)：8-10.

[14] 张禄捷,李荣,姜子涛. 茼蒿叶中总黄酮的提取纯化及抗氧化活性分析[J].食品科学, 2015, 36(24)：40-45.

[15] 吴震生,侯昌,毛文岳. 牡丹花蕊中总黄酮的提取与测定[J]. 食品与药品, 2013, 15(5)：344-345.

[16] 齐建,衡朝晖. 银杏叶提取天然活性黄酮工艺研究[J]. 浙江化工, 2013, 44(10)：16-17.

(编辑 宋官龙)

Optimization on the Extraction Conditions of Flavonoids from Cauliflower Using Response Surface Methodology

Wang Fei, Shan Xiantong, Zhang Jiajing, Wang Zhanyong

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandEnvironmentalEngineering,LiaoningShihuaUniversity,FushunLiaoning113001,China)

The flavonoids was extracted from cauliflower by using ultrasonic-assisted solvent and the response surface methodology was used to optimize the extraction conditions. Firstly, the effects of different extraction factors (ethanol concentration, liquid-material ratio, ultrasonic power, ultrasonic time, bath temperature, bath time and extraction times) on flavonoids yield were studied. And then, Box-Behnken response surface optimization test was carried on the basic of singer factor test result. The optimal conditions were as follows: 65% ethanol, liquid-solid ratio 32∶1 mL/g, ultrasonic power 30 W, ultrasonic time 5 min, bath temperature 50 ℃, bath time 40 min, and extraction time 1. Under this optimum conditions, the actual yield of flavonoids was 1.974 5 mg/g, and it was very close to the prediction value.

Cauliflower; Flavonoids; Extraction; Response surface methodology

1672-6952(2017)01-0018-06

投稿网址：http://journal.lnpu.edu.cn

2016-05-12

2016-06-29

辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划项目(LJQ2014040)。

王菲(1982-)，女，博士，讲师，从事食品生物技术研究；E-mail：107806708@qq.com。

TS209

A

10.3969/j.issn.1672-6952.2017.01.004