超声波—SDS协同提取鸡蛋花总黄酮及其清除自由基能力的测定

陈遂+黄景晟+王娟

摘要：采用超声波-SDS协同体积分数70 %的乙醇提取鸡蛋花总黄酮，通过单因素试验和正交试验确定最优提取工艺参数为：SDS浓度3.0 CMC（3.0×8.2 mmol/L），提取时间25 min，液料比25∶1（mL/g），在此条件下鸡蛋花总黄酮得率为1.59±0.061 %。对鸡蛋花总黄酮清除DPPH·、·OH及O-2 ·三种自由基能力进行了测定，结果表明，鸡蛋花总黄酮具有良好的自由基清除效果，其中对·OH清除率最高，三种自由基清除率随总黄酮浓度增加而增大。研究结果可为鸡蛋花黄酮类物质的开发提供参考。

关键词：鸡蛋花；总黄酮；超声波；提取；自由基清除

中图分类号： TS202.3 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.03.009

鸡蛋花，又名蛋黄花、擂捶花、大季花，系夹竹桃科植物鸡蛋花（Plumeria rubra L. var. acutifolia，别名缅栀子），原产南美，在中国主要分布于广东、福建、广西及云南等地区[1]。鸡蛋花富含黄酮类、萜类等多种活性成分，具有抗焦虑、抗菌及抑制HIV病毒等生物功能[2]。此外，鸡蛋花作为中药材，具有清热祛湿、润肺解毒、止咳化痰等药理作用[4]。目前，关于鸡蛋花的研究主要集中于鸡蛋花挥发油化学成分的分析检测方面[1-3]，而关于鸡蛋花黄酮类成分的抗氧化研究未见报道。

黄酮类化合物因其显著有效的抗氧化活性而一直作為研究重点并被广泛用于食品、药品、日化等领域。醇提法操作简单、工艺成熟，是目前提取黄酮类化合物的常用方法。当辅以超声波时，超声波可通过空化效应破坏植物细胞壁及细胞膜，使溶剂向细胞内扩散并促使胞内有效成分溶出，因而可缩短提取时间[11]。另外，表面活性剂能降低溶剂与植物组织之间的表面张力，使植物组织被充分浸润，加速溶剂深入组织内部，促进活性成分溶出[5]，如阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）在黄酮类化合物提取方面具有明显的增效作用[6]。

本研究采用超声波-SDS协同醇提法提取鸡蛋花总黄酮，通过单因素试验和正交试验优化提取工艺参数，并对鸡蛋花总黄酮清除自由基能力进行测定，从而评价其抗氧化活性。本研究所建立的工艺方法可为植物黄酮类物质的高效提取提供参考，同时，研究结果为后期鸡蛋花黄酮类化合物单体的分离、鉴定以及单体抗氧化活性的测定奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋花：洗净、烘干、粉碎后装袋备用。

芦丁标准品：中国药品生物制品检定所，纯度99.1%。芦丁标准液（0.2mg/mL）的配制：称取10.0mg芦丁标准品，加体积分数95%的乙醇溶解，于50mL容量瓶中定容并摇匀。

1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）： 美国Sigma公司；SDS、乙醇、邻苯三酚、水杨酸、Al（NO3）3、NaNO2、FeSO4、H2O2、NaOH、Na2S2O3、三羟甲基氨基甲烷（Tris）等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

U-3010紫外可见分光光度计：日本HITACHI公司；202-3电热恒温干燥箱：郑州宏朗仪器设备有限公司；KQ-250台式超声波清洗器：苏州江东精密仪器有限公司；5417C高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；HH-8数显恒温水浴锅：金坛市精达仪器制造厂；AL104电子天平：梅特勒—托利多（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鸡蛋花总黄酮提取 称取2.0 g鸡蛋花粉末置于体积分数70 %的乙醇中，加入SDS，然后超声（300 W）提取总黄酮。提取液离心（5000 r/min，10min）后取上清并定容至100mL，测定总黄酮质量，由下式计算总黄酮得率：

得率（%）=（m/W）×100

式中，m为总黄酮质量g；W为鸡蛋花粉末质量g。

1.3.2 总黄酮含量测定 参考马祥[7]等的方法并作改进。吸取1.0 mL上清样品于10mL标准比色管，加体积分数60 %的乙醇至5.0mL；加0.3mL 50 g/L的NaNO2溶液，摇匀静置6 min；加0.3mL 100g/L的Al（NO3）3溶液，摇匀静置6min；加4.0mL 40g/L的NaOH溶液，用蒸馏水稀释至10 mL，静置20 min后倒入比色皿，在波长510nm处测定吸光度。以芦丁标准液为对照，依据标准曲线（y =7.78x + 0.0036，R2 = 0.9982，其中y为吸光度，x为芦丁质量浓度，mg/mL）求得样品中总黄酮质量并计算出得率。

1.3.3 试验设计

单因素试验：依据我们前期试验结果，分别考察SDS浓度、提取时间及液料比三个主要因素对鸡蛋花总黄酮得率的影响，并确定各因素最优水平。

正交试验：在单因素试验基础上，以总黄酮得率为响应指标，建立SDS浓度（A）、提取时间（B）、液料比（C）及空白（D）的四因素三水平L9（34）正交试验，考察各因素对响应指标影响的显著性并确定提取总黄酮最优工艺参数。

1.3.4 清除自由基能力测定

清除DPPH·能力测定：参考吴琼英[8]等的方法并作改进。将总黄酮上清样品稀释成一系列浓度的溶液，将每一稀释度溶液加于2支10 mL试管中，每支试管加2 mL，一支试管再加1×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，一支试管再加乙醇2 mL，充分混匀并置暗处孵育30min，离心（3000 r/min， 10 min）后取上清于波长517 nm处测定吸光度。由下式计算DPPH·清除率（I1）：

I1（%）= [1 - （Ai - Aj） / A0] ×100

式中，Ai为2mL总黄酮溶液+2mLDPPH溶液的吸光度；Aj为2mL总黄酮溶液+2mL乙醇的吸光度；A0为2mLDPPH溶液+2mL乙醇的吸光度（参比）。

清除·OH能力测定： 参考候学敏[9]等的方法并作改进。将总黄酮上清样品用dd水稀释成一系列浓度的溶液。取10 mL试管若干，分别依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL以及不同浓度总黄酮样品溶液2 mL（空白对照以dd水代替总黄酮溶液），最后加入8.8 mol/L H2O2溶液2 mL，混匀并于37℃水浴30min，离心（3，000 r/min， 10 min）后取上清于波长510nm处测定吸光度，参比溶液以dd水代替H2O2。由下式计算·OH清除率（I2）：

I2（%）= [1 - （Ax - Ax0） / A0]×100

式中，A0为空白对照吸光度；Ax为加入样品溶液后的吸光度；Ax0为参比溶液吸光度。

取10 mL试管若干，分别加入pH 8.2的Tris-盐酸缓冲液4.5 mL，25 ℃水浴20min，各试管再加入不同浓度的总黄酮样品溶液0.2mL及30℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL（以10mmol/L盐酸溶液配制），混匀后25℃水浴4min，立即加4滴8mol/L盐酸终止反应。以蒸馏水作空白对照，于波长325nm处测定吸光度。由下式计算 ·清除率（I3）：

I3（%）= （A0 - An） / A0 ×100

式中，A0为空白對照吸光度；An为加入样品溶液后的吸光度。

1.3.5 统计学处理

用SAS 8.2（SAS Institute Inc.， Cary， NC， USA）软件进行数据处理，组间差异比较采用t检验法。所有试验均设3个重复，数据取均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 SDS浓度对鸡蛋花总黄酮得率的影响

室温下，SDS在水中的临界胶束浓度（critical micell concentration， CMC）为8.2 mmol/L[10]。不同倍数CMC的SDS对鸡蛋花总黄酮得率的影响，如图1：

由图1可知，在SDS浓度1.0-3.0 CMC时，鸡蛋花总黄酮得率随溶液中胶束的增加而提高。此后，随着SDS浓度增加，过多的表面活性剂形成过于紧密的胶束系，可能会对总黄酮的浸出产生抑制作用，从而使总黄酮得率略有下降并趋于稳定。

2.1.2 提取时间对鸡蛋花总黄酮得率的影响

提取时间对鸡蛋花总黄酮得率的影响，如图2：

由图2可知，在提取时间5～25min时，鸡蛋花总黄酮得率随提取时间的增加而提高。此后随着提取时间的延长，总黄酮得率不断降低。分析原因可能是长时间超声会对SDS形成的胶束结构造成破坏，同时会导致其他杂质溶出，从而降低了总黄酮得率。

2.1.3 液料比对鸡蛋花总黄酮得率的影响

液料比对鸡蛋花总黄酮得率的影响，如图3：

由图3可知，液料比5∶1～20∶1时，鸡蛋花总黄酮得率随液料比增加而提高较快。此后，液料比增加，总黄酮得率提高缓慢并将趋于稳定。尽管整体看，液料比越大，总黄酮得率越高，但过大的液料比会造成高能耗和溶剂浪费，且有较多杂质溶出，因此考虑到节能及提高效率，液料比不宜过大。

2.2 正交试验结果与分析

正交试验设计及结果，如表1：

由表1可知，各因素对鸡蛋花总黄酮得率的影响大小顺序为：C > A > B；最优提取工艺为A2B2C3，即SDS浓度3.0CMC，提取时间25 min，液料比25∶1。此工艺下鸡蛋花总黄酮提取得率最高：1.59±0.061 %。

方差分析（如表2）结果表明，液料比对鸡蛋花总黄酮得率有显著性影响。

2.3 清除自由基能力测定结果与分析

鸡蛋花总黄酮清除自由基能力的测定结果如图4：

3 结论

参考文献

[1]林敬明，许寅超，冯飞跃，等.鸡蛋花超临界萃取物的GC-MS分析[J].中药材，2001，24（04）： 276-277.

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[3]洪挺，余勃，陆豫，等.鸡蛋花中化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发， 2011（23）：565-570.

[4]邓仙梅，刘敬，谢文琼，等.凉茶常用药材鸡蛋花的研究进展[J].时珍国医国药，2014，25（01）： 198-200.

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[6]董树国， 陆钊， 曹宏梅. 超声波—表面活性剂协同提取桑叶总黄酮[J].食品与发酵工业，2011， 37（11）：243-245.

[7]马祥，晏日安.超声波——表面活性剂协同提取竹叶总黄酮的工艺[J].食品科学，2012，33（22）： 76-80.

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[11] 张灿，张海晖，武妍，等.马兰黄酮类化合物的提取及其抗氧化活性[J].农业工程学报，2011，27（Supp.2）：307-311.