结直肠癌患者循环肿瘤细胞监测的研究进展

陈池生 褚忠华

·综述·

结直肠癌患者循环肿瘤细胞监测的研究进展

陈池生 褚忠华*

尽管近年来结直肠癌手术、化疗、放疗的疗效较前已有明显改善，但仍有15%～20%的结直肠癌患者在诊断时就已发现肝转移，而其余60%亦在后续的治疗过程中发现复发或转移。而外周血中循环肿瘤细胞（CTCs）的检测作为近年来临床研究的热点，在评估治疗癌症的疗效及判断预后等方面有着巨大的潜力。本文就CTCs的分离富集、检测技术及结直肠癌患者中CTCs检测的临床意义进行综述。

结直肠癌；循环肿瘤细胞；分离富集；临床意义

0 前言

2015年中国结直肠癌新发病例数376 300，死亡例数达到191 000［1］。手术及放化疗等综合治疗手段发展到今天，结直肠癌疗效已较前有明显改善，然而有文献统计，仍有15%～20%的结直肠癌患者在诊断时就已发现肝转移，其余60%亦在后续的治疗过程中发现复发或转移［2］。目前肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）等在预测复发和转移方面的灵敏度和特异度都较低，且其和电子计算机断层扫描检查等均存在滞后性的特点。因此找到可以简便而又精准预测复发和转移的标记物尤为重要。外周血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cells， CTCs）作为近年来临床研究的热点，在评估肿瘤疗效及判断预后等方面有着巨大的潜力。

循环肿瘤细胞是指来源于原发肿瘤灶，在各种细胞细胞因子作用下进入循环系统，并逃离了宿主免疫杀伤后能在患者外周血检测到异质性肿瘤细胞［3］。目前已在结直肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中发现了CTCs的存在［4］。CTCs的发生被认为和肿瘤细胞上皮-间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）机理相关，部分侵袭能力较强的CTCs通过EMT在受到EMT靶基因调控后，其上皮标志物如钙粘蛋白、细胞角蛋白等的表达下调而间质细胞的标志物如弹性蛋白及基质金属蛋白酶等表达上调［5］。因此，外周血中的CTCs可能是脱离癌灶进入外周血中的上皮型CTCs，亦或是经过EMT转化从原发灶脱离从而循环在外周血的间质型CTCs。总之，肿瘤转移涉及到复杂的机制，而循环肿瘤细胞从癌灶脱离、侵犯并进入机体循环是肿瘤转移的开始阶段，且为最终转移灶的形成提供了可能。

当前，CTCs检测费比较昂贵，并且不同实验室之间的检测标准并未完全统一，导致其临床应用推广受到一定的限制。但随着该技术不断改进、检测标准的规范化及临床数据的不断完善，CTCs在为结直肠癌患者的预后、病情评估以及对治疗的反应等方面提供的参考价值越来越大。本文就CTCs的分离富集、检测技术及结直肠癌患者中CTCs检测的临床意义进行综述。

1 CTCs的富集方法

CTCs的血液中的密度较低，要求在1亿个白细胞与500亿个红细胞中寻找少数的几个肿瘤细胞［6］，因此，首先需要通过富集技术将CTCs和血细胞二者分离开来。目前主要是通过物理或化学的原理特异性地收集CTCs，富集方法主要有免疫磁珠分离技术、CTCs芯片技术及膜滤过分离肿瘤细胞计数等。

1.1 免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术（IMS）是富集CTCs最常用的方法，其主要作用是让靶细胞表面的抗原与表面包被抗体的磁珠相联结，形成抗原－抗体－磁珠免疫复合物，形成抗原－抗体－磁珠免疫复合物。该复合物若被放于强大的磁场中，即能和其他没被结合的细胞分离，从而达到与血细胞分离的目的［7］。按照其分离的方法分为阳性富集法和阴性富集法。前者使用表面偶联抗CTCs细胞抗体的磁珠，细胞通过与磁珠结合，直接从磁场中被分离出来。其结合的细胞就是循环肿瘤细胞。后者则通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化，如广谱标记物CD45的磁珠，其针对白细胞表面抗原，可以有效地将有核细胞中的白细胞找出并排除，从而剩下没被结合的CTCs，因此大大增加了CTCs的检出数量［8］。Linuma等指出通过CD45磁珠的阴性富集，CTCs的富集效率为原来9倍［9］。而今多将这两种富集策略联合起来以进一步减少血细胞的含量，提高CTCs富集效率，有报道称这种方法的富集效率与一般的分离方法相比可提高1000倍以上［10］。

1.2 CTCs芯片技术

CTCs芯片技术是微流体原理学的实际应用，该芯片将有关CTCs的表面标记物（EpCAM）抗体包埋在芯片上，当样本缓慢经过芯片平板时，EpCAM+细胞会因抗原抗体联结而被捕获，具有较高的灵敏度及特异性。据报道，该方法的敏感性达到了99.1%，而特异性为100%［11］。CTCs芯片技术的应用前景广泛。如Lu等甚至可通过CTCs芯片明确肿瘤来源，通过特制芯片可将结直肠癌和肺癌、前列腺癌等分辨开来［12］。

1.3 膜滤过分离肿瘤细胞技术

膜滤过分离肿瘤细胞技术（ISET）基于CTCs细胞与血细胞的大小不同来分离肿瘤细胞，通过特定孔径大小的滤过膜将CTCs从外周血中分开来，每mL血液中可以提取到至少1个肿瘤细胞，敏感度高，且分离的CTCs保持完整［13］。但该富集方法不具有特异性，其主要适用于肺癌及胃癌等异质性更为明显的恶性肿瘤，当出现抗原的交叉表达或差异表达，其假阳性率升高，这使得其应用受到一定限制［14］。

2 CTCs的检测方法

外周血中的CTCs经过富集后，需采用特异性的检测方法对CTCs及其分子进行进一步的检测以完成最终鉴定。常用的检测技术有免疫细胞化学技术（ICC）、逆转录聚合酶链反应（RT⁃PCR）和流式细胞术（FCM）等。根据其检测原理可分为两大类：基于细胞免疫的标记技术和基于核酸检测的技术。

2.1 基于细胞免疫的标记技术

这是最早也是最常用的技术，其采用抗原抗体结合的原理鉴定CTCs。常用的检测手段有：①免疫细胞化学（ICC），通过将单克隆抗体与肿瘤的特异性表达抗原相结合，并通过酶与底物反应显色对CTCs进行测定。②流式细胞术（FCM），其可对样本自动快速扫描且对细胞的形态学指标、细胞活力、其他表面抗原等进行检测，对CTCs达到高特异性的鉴别，并且对其进行分选［15］。

2.2 基于核酸的检测技术

基于核酸水平的检测主要是采用聚合酶链式反应PCR的方法检测CTCs中的特异性核算片段，包括DNA和mRNA。DNA肿瘤标记物检测方法主要是通过检测肿瘤患者外周血中的CTCs癌基因、抑癌基因的突变或染色体易位等产生的异常DNA。然而非常多实体肿瘤的DNA变化并无显著的特异性，基本不用于CTCs检测，适用范围有限［16］；近年来，逆转录聚合酶链反应（RT⁃PCR）逐渐成为了CTCs研究的重要手段，其已被广泛应用于结直肠癌中［17］。其灵敏度很高，该方法能够在107～108个单核细胞中检测出单个CTC［18］。RT⁃PCR的高敏感性容易带来假阳性率高的问题，如Kowalewska等的研究说明炎症反应也可引起肿瘤抗原mRNA的升高［19］。

3 CTCs在结直肠癌治疗中的临床意义

3.1 CTCs与手术及操作的相关关系

Park等［20］的研究通过在手术前后采集外周血中并检测CTCs中CEA和CK20的mRNA表达量发现手术过程中较手术前有增加的趋势，提示手术可能一定程度上促进肿瘤细胞的血液播散。类似的研究发现，手术操作后48 h内患者的CTCs数目上升，然而结果表明此时的CTCs不具有预后意义。若是术后CTCs持续存在，则是复发的危险因素，且与患者的无复发生存率密切相关［21］。在术前检查方面，Koch等的一项研究发现14%的结直肠癌患者仅在结肠镜检查后才在外周血中检测到了CTCs的存在，提示机械性操作可以导致活的结肠直肠癌细胞进入循环系统的风险增加［22］。尽管上述研究的临床意义需要更多的数据支持，但也已足够引起我们的重视，在进行各种诊疗操作时，尽量选择可替代方案或轻柔操作从而避免肿瘤细胞的医源性血液播散。

3.2 CTCs与抗癌药物疗效及耐药性的评估

肿瘤治疗过程一个重要的挑战就是如何选择安全、可靠、及时的疗效评估手段以验证治疗方法的有效性，CTCs检测在这方面有重要的应用价值。Lankiewicz等［23］发现经过标准方案的化疗后，结直肠癌患者CTCs阳性率由化疗前59%降至化疗后的31%，其下降趋势与影像学一致。Zhang等［24］通过对晚期结直肠癌患者化疗期间的CTCs及其预后进行检测，发现CTCs的持续存在是接受化疗的晚期结直肠癌患者无进展生存期和总体生存率的独立危险因素。随着对CTCs研究的深入，研究者们已经开始针对CTCs进行相应的基因检测。Musella等［25］的研究指出通过CTCs的检测，可以较早期地预测出抗EGFR治疗的疗效。在耐药性方面，Abdallah等研究结果表明通过CTCs的胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TYMS）检测可以预测出对5-FU抵抗的患者［26］。Yang等［27］指出在转移性结直肠癌患者的CTCs中可检测到KRAS基因的突变，而且30%无该基因突变的患者在接受靶向治疗的过程中发生了继发性的KRAS基因突变，提示通过对CTCs及其分子的动态监测，可指导靶向药物的重点应用，减少不必要的费用和药物副作用。

3.3 CTCs与结直肠癌患者的预后

CTCs在判断患者预后方面起着重要的作用，在许多研究中已经有报道CTCs可作为原发性结肠直肠癌预后标志物［28，29］。Allen⁃Mersh等［30］对196例行根治性结直肠癌切除术的患者，在术后24 h进行CTCs检测，发现术后CTCs阳性患者最后出现复发的危险比高于术后病理淋巴结阳性的患者，且两者均阳性的患者发生复发的概率明显增加，说明术后进行CTCs检测可预测复发。而在转移性结直肠癌方面，Cohen等人发现，CTCs≥2个是伴有肝转移的结直肠癌患者的不良预后因素，且同围手术期的死亡率相关［31］。类似地，Groot等［32］的一项荟萃研究表面在可切除的结直肠肝转移或其他转移性结直肠癌患者的外周血中的CTCs的检测与疾病进展和较差的存活率相关，并在多变量分析中证实CTCs检测是一个单独的预后因子。而相比起传统的肿瘤标记物如CEA，CTCs对结直肠癌患者有可能出现远处转移的预示作用要早12个月左右［33］。

4 总结与展望

目前CTCs检测的敏感性和特异性在逐步提高，但由于不同的实验室检测的结果有差异，未来有必要对CTCs的检测进一步标准化。另外，使用单一方法对CTsC进行分析存在较大的缺陷，联合多种特异性标志物及多种方法检测是重要的趋势。在临床意义方面，CTCs与结直肠癌患者术后接受化疗甚至靶向治疗的敏感与否与较大相关性，其高表达更与患者的不利预后相关。然而当深入到分子机制方面，CTCs从原发灶脱离进入循环系统并最终定位于转移灶的机制尚未定论。对于其转移机制的研究及对CTCs亚群鉴定、针对不同亚群CTCs进行个体化治疗将是今后研究的重要方向。

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The development of circulating tumor cells in colorectal cancer

CHEN Chisheng，CHU Zhonghua. Department of Gastrointestinal Surgery，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guang⁃zhou 510120，China.Corresponding author：CHU Zhonghua，chu9009@163.com

Although the efficacy of surgery，chemotherapy and radiotherapy in colorectal cancer has been greatly improved in recent years，15%-20%of patients with colorectal cancer had hepatic me⁃tastases when they were first diagnosed，and 60%of the rest experienced metastatic or recurrent tumors. As a focus of clinical research in recent years，circulating tumor cells have the tremendous potential in evaluating curative effect and prognosis.This article reviews the separation enrichment techniques，detec⁃tion techniques and clinical significance of circulating tumor cells in colorectal cancer.

colorectal cancer；circulating tumor cells；separation enrichment techniques；clin⁃ical significance

R735.3+.5；R735.3+.7

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.02.024

2017-01-13）

广东省自然科学基金（2016A30313353）

510120广州中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科

*通讯作者：褚忠华，Email：chu9009＠163.com