甲状旁腺激素1-34和雷奈酸锶联合使用对去势大鼠骨质疏松症影响的研究

朱庆华，陶周善，谢加兵，杨 民，丁国正

(1.皖南医学院 研究生学院，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院第一附属医院 创伤骨科，安徽 芜湖 241001)

论 著

甲状旁腺激素1-34和雷奈酸锶联合使用对去势大鼠骨质疏松症影响的研究

朱庆华1，陶周善2，谢加兵2，杨 民2，丁国正2

(1.皖南医学院 研究生学院，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院第一附属医院 创伤骨科，安徽 芜湖 241001)

目的 研究联合使用甲状旁腺激素1-34 (PTH)和雷奈酸锶(SR)对去势大鼠骨质疏松症的影响。方法 50只雌性SD大鼠随机分为假手术组(Sham组,n=5)及双侧去卵巢手术组(OVX组,n=45),正常情况下饲养12周后，随机取5只OVX组大鼠和5只Sham组大鼠处死,取胫骨检查骨质疏松模型的建立情况。随后剩下的40只OVX组大鼠随机平均分成4组(10只/组)：OVX对照组、SR组、PTH组和PTH+SR组；SR组、PTH组和PTH+SR组分别给予SR灌胃(625 mg/kg，每周5次)、PTH皮下注射(20 μg/kg，每天1次)和相同剂量的SR灌胃及PTH皮下注射。药物治疗8周后将所有大鼠处死取胫骨行骨密度及微观参数检测，最大载荷及弹性模量的测定和血清P1NP、CTX-1含量的测定。结果 骨质疏松大鼠模型建立成功。与OVX对照组相比，SR组、PTH组和PTH+SR组各组大鼠胫骨骨密度显著增加，骨小梁数量增加，差异均有显著性意义，P<0.05。与OVX对照组比较，SR、PTH及PTH+SR组的Tb.N、Tb.Th、BV/TV及conn.D明显增加，Tb.Sp明显降低，差异有显著性意义，P<0.05。SR组、PTH组和PTH+SR组的胫骨最大载荷及刚度值均高于OVX对照组；与OVX对照组比较，SR、PTH及PTH+SR组大鼠血清中P1NP表达量增加，而CTX-1表达降低，差异有显著性意义，P<0.05。结论 联合使用PTH和SR可以明显增强去势大鼠成骨活性，增加其骨密度，增强骨强度，对去势大鼠骨质疏松症的治疗有叠加作用。

去势大鼠；骨质疏松症；甲状旁腺激素1-34；雷奈酸锶

骨质疏松症是以骨密度下降为特征，骨折危险度增加的全身骨骼疾病。60岁以上老年人患此症的比例达60%～80%[1]。目前抗骨质疏松药物主要通过促进骨形成和/或抑制骨吸收来防治骨质疏松症，如甲状旁腺激素1-34(parathyroid hormone, PTH)、双磷酸盐类。临床上主要通过联合或序贯使用抗骨质疏松药物，最大限度对骨质疏松症进行干预。动物和临床试验证明，PTH可以直接刺激骨形成而增加骨密度，有效降低骨折的发生率[2]。雷奈酸锶(strontium ranelate, SR)作为解偶联剂，同时促进骨形成和抑制骨吸收，对骨代谢具有双向调节作用，增加骨密度，减少椎体和非椎体的骨折[3-4]。本实验将PTH和SR联合应用治疗去势大鼠，观察其对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响，为临床联合药物防治骨质疏松症提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雌性SD大鼠50只，鼠龄12周，体重平均(230±20) g，由上海斯莱克动物公司提供。所有动物均在温度为(24±0.5) ℃，湿度为45%～50%，通风良好的环境下饲养，每周称体重 1 次。

1.2 主要材料和仪器

雷奈酸锶干混悬剂(欧思美)；甲状旁腺激素(1-34)(Sigma-Aldrich)；骨密度测量仪(Norland, XR36)；微计算机断层扫描仪(Micro-CT)(SkyScan, 1076)；全自动生化分析仪 (Beckman, AU5800)；低速离心机(Thermo, ST40)；生物力学实验机(MTS-858，美国)；1型前胶原氨基末端肽(P1NP)酶联免疫吸附试剂盒(Sigma)；1型胶原C端肽(CTX-1)酶联免疫吸附试剂盒(Sigma)。

1.3 实验方法

1.3.1 骨质疏松动物模型的建立

实验大鼠随机分成2组，Sham组(n=5)和OVX组(n=45)。Sham组接受假手术，即暴露双侧卵巢后不切除；OVX组接受去势手术，即切除双侧卵巢。将所有大鼠称重，按3 mL/kg的剂量向腹腔注射10%的水合氯醛，沿背部纵行切开皮肤后行钝性分离，于脊柱旁开0.5 cm处钝性分开肌肉组织，显露卵巢脂肪包被组织，轻轻提起卵巢，于输卵管卵巢交界处用丝线结扎，完整摘除双侧卵巢后缝合创口。正常环境下饲养12周后，从OVX组随机选取5只大鼠与5只Sham组大鼠处死后取下胫骨，用骨密度测量仪检测骨密度，以检查骨质疏松模型建立情况。

1.3.2 实验动物的药物治疗

剩下的40只OVX组大鼠随机平均分成4组(10只/组)：OVX对照组、SR组、PTH组和PTH+SR组，连续给予8周的药物治疗，具体方法如下：SR组、PTH组和PTH+SR组分别给予SR灌胃(625 mg/kg，每周5次)、PTH皮下注射(20 μg/kg，每天1次)皮下注射和相同剂量的SR灌胃及PTH皮下注射，OVX对照组给予相同剂量的生理盐水灌胃和皮下注射。实验大鼠每周称重，调整药物剂量。

1.3.3 各组大鼠右侧胫骨密度及骨微结构参数的测定

所有大鼠在药物治疗8周后处死，完整取下右侧胫骨，用骨密度测量仪检测骨密度，胫骨采用10%的多聚甲醛固定，后用Micro-CT进行扫描检测。具体扫描条件为：图像矩阵为2048×2048，整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp、114 μA、8 W，以0°旋转进行扫描。扫描完成后，对胫骨干骺端感兴趣区域(region of interest，ROI)进行三维重建，以最低阈值为160提取图像信息。获得大鼠胫骨感兴趣区域骨微结构参数：骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁分离度(trabecular spacing，Tb.Sp)及连接密度(connective density，Conn.D)。

档案管理的信息价值是不容忽视的，如果在保存档案是不能保证档案信息的安全性，那么档案的保存将会失去意义。目前，在我国档案的保存并没有什么相关的安全制度，档案的信息也不能得到安全性的保障，所以管理档案信息的安全对于我们来说是非常关键的。现在我们把档案管理与物联网中，而网络终究是虚拟的，没有安全性可言，并不能是我们的档案得到安全性的保障，因此网络的虚拟性是造成档案管理缺乏安全的重要原因。

1.3.4 各组大鼠右侧胫骨最大载荷和弹性模量的测定

骨三点弯曲试实取右侧胫骨，将其置于MTS-858型生物力学试验机上，设置支点跨距17 mm，以中点为加压点，加载速度2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，根据曲线计算最大载荷和刚度。

1.3.5 各组大鼠血清P1NP、CTX-1含量的测定

大鼠处死前心脏取血2 mL，4 ℃静置30 min后，以2000 r/min(离心半径=10 cm)离心10 min，取血清。采用ELISA法于波长450 nm处测定大鼠血清中P1NP、CTX-1的含量。

1.4 统计学方法

2 结 果

骨密度测量仪检测发现，Sham组大鼠的胫骨骨密度为(237.56±31.48)mg/cm2，而OVX组大鼠的胫骨骨密度为(170.54±30.44)mg/cm2。相对Sham组，OVX组大鼠的骨密度下降了39.30%(P<0.05)，骨质疏松动物模型建立成功。

2.2 各组大鼠药物治疗后胫骨骨密度变化

药物治疗8周后，各组大鼠胫骨骨密度如表1所示。相对于OVX对照组，SR组、PTH组、PTH+SR组各组胫骨骨密度分别增加了20.33%、24.78%、39.68%，差异有明显的统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠胫骨干骺端感兴趣区域骨密度及骨微观参数情况

1)与OVX对照组比较,P<0.05; 2)与SR组比较，P<0.05; 3)与PTH组比较,P<0.05

2.3 Micro-CT评估结果

Micro- CT对各组大鼠胫骨干骺端感兴趣区域进行扫描的结果如图1所示，SR组、PTH组、PTH+SR组骨小梁的数量明显多于OVX对照组，而且骨小梁联系紧密，骨小梁更粗。与OVX对照组比较，SR、PTH及PTH+SR组的Tb.N、Tb.Th、BV/TV及Conn.D明显增加，且PTH+SR组最高，Tb.Sp明显降低，PTH+SR组最低，差异均有显著性意义，P<0.05。见表1。

图1 各组大鼠胫骨干骺端感兴趣区域Micro-CT扫描结果Fig 1 Micro-CT scan results of the interested area in tibia epiphysis

2.4 骨生物力学结果

在胫骨三点弯曲试验中，SR组、PTH组和PTH+SR组的最大载荷及刚度值均高于OVX对照组，PTH+SR组最高，且各组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠胫骨三点弯曲试验的结果

Tab 2 Three point bending test parameters of rats tibia

组别最大载荷(N)刚度(N/mm)OVX对照组97.9±13.5188.6±17.4SR组171.3±29.21)274.4±27.71)PTH组 176.8±33.21)2)285.9±30.21)2)PTH+SR组198.7±35.81)2)3)337.6±34.41)2)3)

1)与OVX对照组比较,P<0.05; 2)与SR组比较，P<0.05; 3)与PTH组比较,P<0.05

2.5 血清P1NP和CTX-1含量检测

各组大鼠在药物治疗8周后，血清P1NP、CTX-1含量检测结果如表3所示。与OVX对照组比较，SR、PTH及PTH+SR组大鼠血清P1NP含量降低，且PTH+SR组最高，差异均有显著性意义(P<0.05)；与OVX对照组比较，SR、PTH及PTH+SR组大鼠血清CTX-1含量升高(P<0.05);SR、PTH及PTH+SR三组间比较，差异无显著性意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清P1NP和CTX-1含量

1)与OVX对照组比较,P<0.05; 2)与SR组比较，P<0.05; 3)与PTH组比较,P<0.05

3 讨 论

骨质疏松症的病因复杂，是一种长期的慢性疾病[5]。临床上治疗骨质疏松症的药物种类繁多，主要分为基础药物、骨转换抑制剂、骨形成促进剂和锶盐类的解偶联剂。对于骨质疏松症的治疗，本实验拟通过联合使用药物，通过药物间的相互作用，相互取长补短达到最大程度的疗效。雌性大鼠的骨代谢过程相对稳定，特别是切除卵巢后的激素改变和骨骼变化与人类相似[6]。本研究采用雌性大鼠作为实验对象，切除卵巢的雌性大鼠在饲养12周后骨密度相对于Sham组大鼠下降39.30%(P<0.05)，表明我们的骨质疏松动物模型的建立是可行的。

在机体内，PTH参与钙和磷的代谢过程[7]，主要通过激活环腺苷酸/蛋白激酶A (cAMP/PKA)、磷脂酶C/蛋白激酶C (PLC/PKC)等第二信使系统诱导成骨或破骨作用[8]。动物研究已经证明，小剂量间歇性的给予PTH有促骨生成作用[9]。由于PTH半衰期短，本实验采用20 μg/kg和每天1次的皮下注射，实际就是一种小剂量间歇的给药方式。药物治疗8周后，PTH组去势大鼠骨密度和骨微结构较OVX对照组改善，证明了PTH小剂量间歇性给药的促成骨作用。锶盐类药物在促进骨形成和抑制骨吸收方面可同时作用，具有双向调控机制[10-11]。促进骨形成的调控，SR通过增加胶原蛋白与非胶原蛋白的合成，同时提高细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型骨胶原水平，增强成骨细胞增殖及分化，增加成骨细胞介导的骨形成。抑制骨吸收的调控，SR能剂量依赖地下调成骨细胞内白介素(IL)-6水平从而抑制破骨细胞的增殖及分化，抑制破骨细胞介导的骨吸收[12]。在本实验中，SR组去势大鼠在接受药物8周后，骨密度明显提高，胫骨干骺端的骨量也明显增加。

PTH联合二膦酸盐类对骨质疏松的治疗并没有明显的叠加作用，不管是在动物体内，还是临床上[13-14]，甚至二膦酸盐类会影响到骨小梁的质量。原因可能是由于PTH成骨作用有自己的时段性，二磷酸盐类抑制破骨细胞活性，同时会干扰骨吸收和骨形成的偶联关系，因此二磷酸盐类使用并不能很好的和PTH所产生的促进成骨作用相叠加。在增加皮质骨厚度和松质骨骨小梁体积密度方面，雷奈酸锶比其他二磷酸类药物的作用更明显[15-16]。本实验对去势大鼠骨质疏松模型联合使用PTH和SR治疗，实验中使用的SR是每周5次，所以可以很好地和PTH作用疗效叠加，同时SR也有部分成骨效果，血液中P1NP及CTX-1浓度的改变进一步的证实这点。在药物治疗8周后分析Micro-CT扫描结果，从结果可以发现相对于单独使用PTH或SR，联合使用两种药物对去卵巢大鼠胫骨骨密度提高更明显，明显增加胫骨干骺端的骨量。各组大鼠胫骨三点弯曲试验也表明PTH+SR组有着最高的最大载荷及刚度值。

在本实验中样本数量有限，药物治疗时间为8周，时间相对较短。就目前实验结果可以表明，联合使用PTH和SR对于去势大鼠骨质疏松症的治疗可以明显增强成骨活性，增加其骨密度，增强骨强度，且效果较单独使用任何一种药物要明显，两种药物有协同作用。我们认为SR是比较适合和PTH联合使用的抗骨质疏松药物，联合使用PTH和SR对去势大鼠骨质疏松症的治疗有叠加作用。具体两种药物联合使用的合适剂量和联合药物增加的不良反应有待下一步研究阐明。

[1] Silverwood B. Building healthy bones[J]. Paediatric Nursing, 2003, 15(5):27-29.

[2] Brüel A, Vegger JB, Raffalt AC, et al. PTH (1-34), but not strontium ranelate counteract loss of trabecular thickness and bone strength in disuse osteopenic rats[J]. Bone, 2013, 53(1):51-58.

[3] Kaufman JM, Audran M, Bianchi G, et al. Efficacy and safety of strontium ranelate in the treatment of osteoporosis in men[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2013, 98(2):592-601.

[4] Przedlacki J. Strontium ranelate in post-menopausal osteoporosis[J]. Endokrynologia Polska, 2011, 62(1):65-72.

[5] Targownik LE, Lix LM, Leung S, et al. Proton-pump inhibitor use is not associated with osteoporosis or accelerated bone mineral density loss[J]. Gastroenterology, 2010, 138(3):896-904.

[6] Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions[J]. Clin Orthop Relat Res, 1986, 205(205):299-308.

[7] Kraenzlin ME, Meier C. Parathyroid hormone analogues in the treatment of osteoporosis[J]. Nat Rev Endocrinol, 2011, 7(11):647-656.

[8] Yang D, Guo J, Divieti P, et al. Parathyroid hormone activates PKC-delta and regulates osteoblastic differentiation via a PLC-independent pathway[J]. Bone, 2006, 38(4):485-496.

[9] Saito M, Marumo K. Effects of parathyroid hormone (teriparatide) on bone quality in osteoporosis[J]. Clini Calcium, 2012, 22(3):343-355.

[10] Reginster JY, Kaufman JM, Goemaere S, et al. Maintenance of antifracture efficacy over 10 years with strontium ranelate in postmenopausal osteoporosis[J]. Osteop Int, 2012, 23(3):1115-1122.

[11] Rizzoli R, Chapurlat RD, Laroche JM, et al. Effects of strontium ranelate and alendronate on bone microstructure in women with osteoporosis. Results of a 2-year study[J]. Osteop Int, 2012, 23(1):305-315.

[12] Takaoka S, Yamaguchi T, Yano S, et al. The Calcium-sensing Receptor (CaR) is involved in strontium ranelate-induced osteoblast differentiation and mineralization[J]. Horm Metab Res, 2010, 42(42):627-631.

[13] Li YF, Li XD, Bao CY, et al. Promotion of peri-implant bone healing by systemically administered parathyroid hormone (1-34) and zoledronic acid adsorbed onto the implant surface[J]. Osteop Int, 2013, 24(3):1063-1071.

[14] Altman AR, Tseng WJ, Bakker CMJD, et al. A Closer Look at the Immediate Trabeculae Response to Combined Parathyroid Hormone and Alendronate Treatment[J]. Bone, 2014, 61(4):149-157.

[15] Ferrari S. Comparing and contrasting the effects of strontium ranelate and other osteoporosis drugs on microarchitecture[J]. Osteop Int, 2010, 21(2 Supplement):437-442.

[16] Rizzoli R, Laroche M, Krieg MA, et al. Strontium ranelate and alendronate have differing effects on distal tibia bone microstructure in women with osteoporosis[J]. Rheumatol Int, 2010, 30(10):1341-1348.

Effect of combined use of parathyroid hormone 1-34 and strontium ranelate on osteoporosis in ovariectomized rats

ZHU Qinghua1, TAO Zhoushan2, XIE Jiabing2, YANG Min2, DING Guozheng2

(1.GraduateSchool,WannanMedicalCollege,Wuhu241001,China; 2.DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241001,China)

Objective To investigate the effect of combined use of parathyroid hormone 1-34 (PTH) and strontium ranelate (SR) on osteoporosis in ovariectomized rats. Methods Fifty female SD rats were sham operated (Sham,n=5) and ovariectomized (OVX,n=45). After 12 weeks, five rats of each group were randomly selected to test the establishment of osteoporosis model. Then all rats in OVX group were randomly divided into 4 groups(10 rats /group): OVX control group, SR group, PTH group and PTH+SR group. The rats were given 625 mg/kg SR, 5 times a week by intragastric administration in SR group, 20 g/kg PTH once a day by subcutaneous injection in PTH group, and the combined use of SR and PTH in PTH+SR group. After 8 weeks of drug treatment, all rats were executed to examine the tibial bone mineral density and bone histomorphometry parameters, maximum load and elastic modulus, and test serum P1NP and CTX-1 levels. Results Osteoporosis rat model was established successfully. And compared with the OVX control group, bone mineral density increased and bone histomorphometry parameters improved in SR group, PTH group and SR+PTH group. Compared with the OVX control group, Tb.N, Tb.Th, BV/TV, Conn.D improved and Tb. Sp reduced evidently in SR group, PTH group and SR+PTH group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The maximum load and stiffness of tibia in SR group, PTH group and SR+PTH group were higher than OVX group; compared with the OVX control group, the P1NP parameter of rats serum improved and the CTX-1 parameter of rats serum reduced in SR group, PTH group and SR+PTH group, and the difference was statistically significant(P<0.05). Conclusion PTH and SR can significantly enhance the osteogenic activity, increase the bone mineral density, and enhance the strength of the bone, and they have a superposition effect on osteoporosis in ovariectomized rats.

ovariectomized rats; osteoporosis; parathyroid hormone 1-34; strontium ranelate

国家自然科学基金项目(81341054)

朱庆华(1992-)，男，硕士研究生。E-mail：zhuqinghuawnmc@163.com

丁国正，主任医师。E-mail：dingguozheng@medmail.com.cn

10.11724/jdmu.2017.01.02

R737. 33

A

1671-7295(2017)01-0008-05

朱庆华，陶周善，谢加兵，等.甲状旁腺激素1-34和雷奈酸锶联合使用对去势大鼠骨质疏松症影响的研究[J].大连医科大学学报，2017,39(1)：8-12.

2016-11-26；

2016-12-29)