漆酶及其应用研究进展

李晨歌

(陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000)

漆酶及其应用研究进展

李晨歌

(陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000)

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在造纸、食品、环境治理以及生物能源等方面有广泛的应用。介绍了漆酶的结构特征、催化机制、活性影响等因素，讨论了其工业化生产应用状况，并展望了漆酶的应用前景。

微生物漆酶；异源表达；工业化生产；细菌漆酶

漆酶(laccase，ECl．10．3．2)是一种含铜的多酚氧化酶(polyphenol oxidases，PPO)，被抗坏血酸、胺类、O2催化酚类等物质氧化后，最终生成相应的产物与水。过氧化物酶、酪氨酸酶等与漆酶协同组成了酚类氧化酶群体，广泛存在于自然界中。同时，血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)、漆酶(Laccase)等多种类型的酶，均是蓝色多铜氧化酶家族的成员之一[1]。

人们在研究中发现漆酶不仅存在于高等植物中[2]，同时在微生物中也广泛地存在。科学家发现担子菌中的白腐菌[3]是最重要的生产者。Alexandre[4]等人对细菌基因组和蛋白质的数据库进行同质性研究分析，发现原核生物中也有漆酶的存在。

1 微生物漆酶的分布及其生理功能

微生物漆酶在自然界中大量存在，大量落叶覆盖的林区土壤中，污水处理厂周围的活性泥污中，河流及葡萄酒酒厂中的污水，水稻等作物的根部，被有机物垃圾、有机染料、石油污染的土壤、海洋，纺织厂的工业废水和造纸厂的木质纤维废水等等。

目前，真菌漆酶中的担子菌和子囊菌是人们集中研究的热点，而担子菌中的白腐菌是目前原核和真核微生物中所知的唯一能够自身利用氧化酶系统将纤维木质素降解为二氧化碳的一种真菌。此外，真菌漆酶也是部分致病真菌的毒性成分之一，在真菌的分化、色素的形成中发挥着重要的作用。与真菌漆酶相比，细菌漆酶反应条件及动力学特征截然不同，其反应速度相比会变得很慢，铜离子被认为是一个必要因素，因此细菌漆酶通常被称为“多铜氧化酶”或“多酚氧化酶”，时常也被定义为漆酶类似物(1accase-like)。

2 漆酶的结构特征和催化机制

大量的研究表明，真菌漆酶和细菌漆酶均是以单蛋白体形式存在的糖蛋白，通常情况下这些蛋白的分子量相差较大，而且糖基化的程度也存在差异，可是真菌漆酶与细菌漆酶的蛋白结构大体相似，均为球状结构，分别由三个杯状(cupredoxin-like)结构域构成，且每个结构域中都含有β的圆桶状结构。

钞亚鹏，钱世钧[5]等人依据对漆酶晶体衍射、动力学和光谱学的研究中发现，一般漆酶蛋白结构中含有4个铜原子(图1)，这4个Cu2+共同构成了漆酶催化反应中的活性中心。这4个铜离子有三种形式存在，即T1Cu铜原子，T2Cu铜原子和T3Cu铜原子。T1Cu铜原子的周围由一个半胱氨酸和组氨酸构成，T1Cu铜电子在顺磁共振光谱(Electronic Paramagnet Resonance，EPR)的可见光区显示4条电子转移条带，其中由Cys→T1Cu出现的条带亮度最大，这是漆酶显示蓝色的主要原因。T2Cu是由两分子的咪唑和一分子的水配位形成的一种四面体几何构型。人们发现EPR光谱中含有极宽的超精细裂分。TCu3a，TCu3b与一个氢氧化物分子和三个组氨酸分子一起共同构成一种受阻的四面体几何构型，氢氧化物做为桥将两个Cu2+连在一起。由于Cu-Cu共价体可以产生强烈的反铁磁性的特性，因此很难检测到EPR光谱信号。

图1 漆酶13H9的结构

漆酶催化各种底物的反应方式可能如下：首先，反应底物与处于酶活性中心的T1Cu铜原子位点相结合，且经过Cys-His途径将底物-T1Cu铜原子传递到由T2Cu和T3Cu结合构成的三核位点上，该三核位点接着将电子传递给已结合在活性中心的第二底物氧分子上，最终还原产生水。在整个反应过程中，漆酶的充分还原需要有连续不断的单电子氧化作用来满足。此时，处于还原态的酶分子再通过将四个电子转移传递给分子氧，最终氧化反应生成水。因此漆酶又被称为分子电池。

3 微生物漆酶活性的影响因素

3.1 pH值

一般情况下，每种漆酶氧化底物的时侯，都会有一个特定的pH值区间。且不同的氧化底物则所测到的pH值区间也不同，这可能是不同的底物参与了改变漆酶活性中心周围酸碱基团离解状态的原因。同时，发现一定范围内pH值的浮动变化会不同程度地影响漆酶的可逆变性，一旦超过一定的pH值区间范围，漆酶则会不可逆地失活，使漆酶的催化活性受到影响。一般情况，真菌漆酶与细菌漆酶的pH值范围存在差异，且真菌漆酶的pH值范围偏向酸性，细菌漆酶则偏向中性和碱性，从而细菌漆酶更偏向应用于工业化的生产。同时，人们发现不同种属的漆酶其pH值范围也不同，且漆酶反应中，作用底物不同其最适pH值也不同。Chunjuan Gu[6]等人从Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，通过不同的底物ABTS，愈创木酚，2，6-二甲氧基苯酚，丁香醛连氮，分别测得最适反应pH值分别为3.0、5.0、5.0、6.0和3.0、5.0、5.0、6.2。

3.2 温度

漆酶的酶促反应中，温度是影响漆酶活性的关键因子之一。一般情况下，刚开始反应时，酶促反应的速率会随温度的升高而增大，当达到一定值后则会随温度升高而逐渐降低，甚至失活。通常，真菌漆酶的热稳定性不强，50℃下反应数分钟后其活性丧失。学者Jordan等人从嗜热白腐菌菌株中获得一株在60℃的条件下反应9h仍保持完整酶活的耐高温漆酶菌株。然而，细菌漆酶的热稳定性则显著高于真菌漆酶，中国农业科学院生物技术研究所的余小霞[7]等人发现漆酶CotA在60℃保温90min后仍有71.70%的剩余酶活。

3.3 金属离子

大多数金属离子(Cu2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Hg+、Zn2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、AI3+、Fe3+、Pt4+)不同程度地影响漆酶的活性。大量报道称，一定浓度的Cu2+可以促进漆酶的活性，而裴佐蒂[8]通过对灰盖鬼伞漆酶在毕赤酵母中的异源表达分析发现，Cu2+不能促进重组漆酶，反而在10mM时抑制重组漆酶的活性。我们在研究漆酶Lac13H9的酶学性质时发现，不同终浓度的铜离子(0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)，对漆酶的剩余酶活分别为110%、200%、100%、42%、38%、35%、30%，即低浓度促进，高浓度抑制。这也可能是因为不同的漆酶结构所需要Cu2+的浓度阈值有关。Matthias Gunne[9]等人研究不同的漆酶自身所含有的铜离子个数不一样，从1～9不等，当外源铜离子在一定的阈值范围内，则促进酶的活力，超过一定的范围则对漆酶的反应不敏感，甚至起抑制作用。

也有报道发现，由于漆酶自身构造上的差异，同一种金属离子对不同的漆酶表现不同的作用，如K+对大多数漆酶有激活作用，但对漆酶CotA有较强的抑制作用；Cu2+是大多数漆酶的激活剂，但对灰盖伞菌漆酶(Coprinopsiscinerea)则表现出了一定的抑制作用。

4 微生物漆酶基因的克隆

目前，报道克隆得到的漆酶基因有60余种，同时发现一些漆酶得到了表达，部分已经克隆到的漆酶基因如表1所示。

5 漆酶基因的重组表达

由于漆酶的本身性质，很难实现表达，且表达量很低。近年来，漆酶在不同的宿主菌中通过异源表达来提高表达量，部分有关原菌株和表达宿主的相关数据如表2所示。

表1 已克隆到的漆酶基因

表2 漆酶基因的重组表达

6 漆酶的工业化应用

6.1 环境保护

目前，有机农药的使用和大量印刷厂的废水已成为当前工业领域最重要的水体污染之一。有报道称漆酶可以在一定程度上对染料进行脱色降解。北京大学陈辉[10]等人在对漆酶催化氯酚类有机物的降解研究结果表明，漆酶可以不同程度地对三种氯酚类有机物(2，4-二氯酚、4-氯酚和2-氯酚)进行降解，降解率分别为94%、75%和69%，由此可见漆酶的确对氯酚类有机物有不同程度的降解作用。武汉科技大学任大军等人对漆酶在共基质体系下吲哚的去除进行了大量研究后发现，在含有苯酚的反应体系中，漆酶去除吲哚的效果更加显著，并且发现漆酶在去除共基质中的吲哚和苯酚的同时，苯酚的存在也进一步促进漆酶对吲哚的去除，两者相互协调共同作用。Chunjuan Gu[11]等人从Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，发现对13种不同的有机染料均有不同程度的降解，且Lac3的降解率均略高于Lac4。同时，我们又在降解体系中加入中介体HBT与未加中介体的对照，发现加入中介体HBT的降解率均明显高于未加中介体的，甚至有些降解率提高到了98%；将细菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac 3协同作用一起研究对染料孔雀石绿(MG)的降解作用时发现，当仅有细菌漆酶Lac13H9参与降解染料12h后，降解率几乎仅有5%左右；而在细菌漆酶Lac13H9的基础上加入中介体HBT时，降解率为40%；将细菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac3混合不加中介体，12 h的染料降解率为70%，而在两种漆酶混合的基础上加入中介体HBT时，其降解率在12h后为94%，因此将细菌漆酶和真菌漆酶一起协同作用的基础上，添加中介体是高效降解染料的一种新的研究趋势。

6.2 造纸工业

通过漆酶参与的生物制浆工艺与传统的化学方法相比，在降低能耗大和节约设备的基础上，进一步避免了传统化学方法降解木质素时不够彻底的问题。与此同时用漆酶进行的生物制浆也避免了传统的氯法漂白产生废水污染和漂白后的纸张极易反弹等一系列的弊端现象，显著调高了纸张的质量和强度。

由于漆酶自身含有可以通过氧化作用降解木质素的结构域，因此在生物制浆、木质纤维素污染的环境治理等方面均有潜在的商业价值。在整个木质素的降解中，细菌和真菌相互协同作用发挥降解作用。首先，细菌介入初期的降解反应，在木质素降解早期，经过自身初级代谢产物作用于木质纤维物质，从而使其发生改性，接着真菌漆酶参与后续的降解工作，通过自身的高氧化还原电势的作用，开始高效地分解木质纤维素。由于漆酶的氧化还原电势一般较低的原因，一方面Jausovec[12]等人通过在漆酶的结构中引入羧基和醛基基团来改善漆酶的电势，为更好地氧化纤维素做了基础的研究；另外，在反应体系中常常需要加入少许低分子质量的化合物作为中介体参与反应，常见的有ABTS、HBT等。这些中介体在氧化还原过程中起到传递电子的作用，从而使木质素聚合或降解。在当前的研究中发现，漆酶有效介体中除典型的HBT和ABTS外，盐酸异丙嗪(PTC)、2-亚硝基-1-萘酚-4-磺酸(HNNS)、N-羟基乙酰苯胺(NHA)等含有-NO、-NOH基团的化合物也是漆酶的有效介体[13,14]，可是中介体的价格问题一直是困扰工业化生产的关键因素，今后还需要寻找价格低廉的中介体以利于大量的工业化生产。Fernandez[15]等人通过商业漆酶的治疗，实现了漆酶在商业贴面板方面的应用。疏水化合物(没食子酸月桂醇酯)通过一个商业漆酶酶治疗，只有当漆酶存在于木材治疗时可以更好地增加木材的疏水化作用，从而增加木材表面的疏水性，实现了与疏水化合物没食子酸月桂醇酯更好的结合，有助于改善木材表面疏水性的永久性。

6.3 食品工业

在食品工业中，漆酶的研究涉及到各种果汁、葡萄酒、啤酒等的生产、酿造等多个领域。因为果汁、酒类中含有芳胺类或酚物质，因此在其储存期通常会出现浑浊、沉淀的现象。由于漆酶具有降解酚类有机物的特性，麦芽汁经过漆酶适当的处理后，其中的酚被氧化，则有助于提高果汁及酒类的透明度和口感质量。啤酒和葡萄酒通过经固定化酶的处理，将酚类等物质除去，从而能够长期地储存并长久保持澄清状态。同时王岁楼[16]等研究发现，漆酶在加速食药用菌制种过程中的木质素的分解方面也有应用。

6.4 纺织工业

在纺织工业中，漆酶已经显示出强大的优势和发展潜力。根据漆酶对染料降解的原理,在纺织染整方面主要用于染色织物上浮色的生物酶洗、牛仔服装的仿旧整理、印染废水的脱色和棉织物的生物漂白。固定化的漆酶酶洗工艺可以替代传统的皂洗工艺,有效去除纯棉针织染色后表面浮色，从而提高织物的湿处理牢度，并进一步降低后处理残液的色度，大大减轻印染废水处理的负担，有利于生态环境保护[17]。

6.4 生物技术领域

在生物监测方面，主要体现在免疫检测和生物传感器两个方面。免疫检测过程中，漆酶可能将替代辣根过氧化物作为新的标记酶。Ghindilis[18]等人依据漆酶在催化反应过程中能够消耗O2转化产生电信号，而该信号又容易被高灵敏检测的机理，通过运用DEAE-纤维素固定漆酶，制成不同类型的高活力的稳定器，用来监测监视茶叶中茶酚的情况，并且这种类型的高灵敏度传感器可以被用来对来自石油、煤炭、天然气，页岩气等工业中酚类等物质的监测。Babadostu[19]等人对漆酶的固定化作用进行大量的分析研究，通过利用漆酶的固定化与纳米磁石的结合实现了精确检测酚类化合物的前景。

在指示剂方面，由于漆酶在催化反应的过程当中可以形成有色产物，如ABTS氧化时可产生从浅绿到深绿的不同有色产物，因此可以制造渗漏指示剂和保鲜指示剂。

在生物能源方面，主要利用漆酶作为催化剂，将燃料的化学能转化为电能从而制造生物燃料电池。目前生物燃料电池仍然存在着工作寿命短的问题，还需大量细致地研究。Schubert[20]等人通过设计人工神经网络(ANN)和遗传算法(GA)获得更精确的的各项指标来预测和改造以漆酶为中介体的氧化还原系统，这种系统可以在氧化生成碘方面进行应用，在工业化应用方面具有潜在的价值。

漆酶还在有机物的合成，非抗体淄醇类药物和抗癌药物的生产，树脂材料[21]等方面均有着广阔的潜在应用前景。

7 结语

迄今为止，漆酶的发现历史已有140多年，经过各国科学家的不懈努力，漆酶的研究工作已取得重要的进展，生化研究、三维结构、催化机理等都有了进一步的研究。目前已有60余种漆酶的基因被克隆并获得进一步分析，其中一些已实现了异源表达。但是依旧存在很多的难题亟待解决，一方面漆酶异源表达调控的相关机理研究还未突破，另一方面，距离漆酶的大规模工业化生产还需要时间。可以预见，今后一段时期的工作主要集中在探索研究漆酶新的表达途径以及选择新的表达宿主，并且通过基因敲除、诱变等基因工程技术寻找高表达，并且能够应用于大量工业化生产的漆酶菌株上。

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【责任编辑 赵建萍】

Research Progress in Laccase and Its Application

LI Chen-ge

(CollegeofAgricultureandForestry,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu)

Laccase is a kind of polyphenol oxidase containing copper, which is widely used in paper making, food, environmental management, biological energy and other industries. The present paper introduces the structural characteristics, catalytic mechanism, active influence and other factors of laccase, discusses its application of industrial production and forecasts its future applications.

microbial laccase; recombinant expression; industrialized production; bacterial laccase

1674-1730(2017)01-0062-05

2016-02-23

李晨歌(1989—)，女，甘肃庆阳人，助教，硕士，主要从事植物保护及生物方向研究。

Q814

A