PP2A对转化生长因子β1诱导的淋巴瘤细胞凋亡的影响*

赵 哲，刘 莉，刘 琨，姚 平，汪茂荣

湖北民族学院附属民大医院血液内科，恩施 445000

PP2A对转化生长因子β1诱导的淋巴瘤细胞凋亡的影响*

赵 哲，刘 莉，刘 琨，姚 平△，汪茂荣

湖北民族学院附属民大医院血液内科，恩施 445000

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的效应及机制。方法 采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激Raji细胞，流式细胞术检测0、24、48、72 h细胞凋亡情况；定量PCR法检测Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3 mRNA表达；Western blot法检测Bcl-2，Bcl-xl以及Caspase-3蛋白表达及细胞外信号调节激酶ERK1/2磷酸化情况；蛋白磷酸酶活性测定体系检测TGF-β1刺激下蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性变化；观察不同浓度PP2A抑制剂冈田酸(okadaic acid，OA)对TGF-β1诱导的细胞凋亡的干预效应。结果 5 ng/mL TGF-β1刺激24、48、72 h后细胞凋亡率分别为(29±3)%、(47±4)%、(60±5)%，差异有统计学意义(均P<0.05)；同时，随着刺激时间延长，Bcl-2、Bcl-xl mRNA和蛋白表达逐渐降低，Caspase-3 mRNA和蛋白表达逐渐增加，差异有统计学意义(均P<0.05)；ERK1/2总蛋白表达无显著差异，其磷酸化状态p-ERK1/2随TGF-β1刺激时间的延长逐渐减少；PP2A活性在TGF-β1干预15 min后开始升高，1 h达峰值；100、200 nmol/L的OA分别预处理后细胞凋亡率明显下降，TGF-β1组为(60±5)%，干预组分别为(32±4)%、(24±3)%，差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 TGF-β1可能通过活化PP2A、抑制ERK1/2通路相关基因的表达而诱导B细胞淋巴瘤Raji细胞凋亡。

转化生长因子β1； 伯基特淋巴瘤； 细胞凋亡； 蛋白磷酸酶2A

转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一种广泛参与并调节机体细胞增殖、分化和凋亡等功能的重要细胞因子[1-2]。在肿瘤中，TGF-β1具有双向调控作用，既能够抑制肿瘤细胞的增殖，又能够促进肿瘤的发生发展[3]。关于TGF-β1诱导的肿瘤细胞凋亡和生长抑制作用已经在多种细胞中得到验证，包括人和小鼠淋巴细胞以及多种淋巴瘤细胞系[4]。由于淋巴瘤细胞本身可以产生TGF-β1，因此，多种淋巴恶性肿瘤细胞对内源性TGF-β1敏感性降低。但是，通过外源性增加TGF-β1剂量仍然可以诱导淋巴瘤细胞凋亡[5]。然而，目前对于TGF-β1诱导淋巴瘤细胞凋亡的机制仍不十分清楚。本研究以Raji细胞为研究对象，观察TGF-β1诱导淋巴瘤细胞凋亡并探索其可能的诱导机制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)，RPMI 1640培养液、胎牛血清(FBS，美国Gibco)，RT-PCR试剂盒(美国Fermentas)，PP2A磷酸酶活性检测试剂盒(美国Promega)，人重组TGF-β1(美国Peprotech)，Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，兔抗人Bcl-2(美国Abcam)、兔抗人Bcl-xl(美国BD)、兔抗人Caspase-3(美国R&D)、小鼠抗人GAPDH(美国Epitomic)、兔抗人磷酸化p-ERK1/2(美国CST)、兔抗人ERK1/2(美国CST)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔/鼠IgG(美国Abcam),冈田酸(okadaic acid，OA，美国Sigma)。流式细胞仪(美国BD公司)，凝胶成像和化学发光分析系统(美国Alpha FlurochemTM公司)。

1.2 细胞培养及分组

Raji细胞用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养于37℃、5%CO2、95%空气湿度培养箱中培养。隔日换液，每3天传代1次。取对数生长期的细胞进行相关实验。在给予TGF-β1刺激前换用无血清培养液培养细胞12 h使同步化。实验分组：对照组(Control)、TGF-β1刺激组(24、48、72 h)、100 nmol/L OA+ TGF-β1刺激组、200 nmol/L OA+ TGF-β1刺激组。无血清培养同步化后，OA预处理1 h后再给予TGF-β1刺激。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡

根据BD公司提供的Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒说明书，收集各组细胞，PBS洗涤2次，离心；然后用250 μL结合缓冲液重悬细胞并使其密度为(4～5)×105/mL，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC及2 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min，离心收集细胞，用500 μL结合缓冲液冲洗细胞1次，再次离心后用500 μL缓冲液重悬，以流式细胞仪检测分析。每次实验设2个复孔，实验重复3次。

1.4 实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3mRNA表达

按照Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA并逆转录成cDNA，然后按以下条件进行PCR。Bcl-2引物：上游5′-TCGCCCTGTGGATGACTGA-3′，下游5′-GCATCCCAGCCTCCGTTATC-3′，片段长度189 bp；Bcl-xl引物：上游5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，下游5′-TCCATCTCCGATTCAGTCCCT-3′，片段长度119 bp；Caspase-3引物：上游5′-GATTATCCTGA-GATGGGTTTATGTAT-3′，下游5′-ATCACGC-ATCAATTCCACAAT-3′，片段长度124 bp；β-actin引物：上游5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTA-CTCT-3′，下游5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCT-AGAA-3′，片段长度153 bp。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、55℃30 s、72℃30 s，共32个循环，72℃延伸10 min。以β-actin为内参，应用相对定量法2-ΔΔCt进行定量分析。每次实验设2个复孔，实验重复4次。

1.5 Western blot检测蛋白表达

RIPA裂解并收集各组细胞，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白20 g/孔，在含SDS-PAGE中电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上；PVDF膜经5%脱脂牛奶(1×TBST缓冲液配制)室温封闭1 h，与一抗(Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、GAPDH、p-ERK1/2、ERK1/2)4℃孵育过夜。1×TBST洗膜(10 min×3次)，与辣根过氧化物酶偶联的二抗37℃摇床孵育1 h。经1×TBST洗涤3次后用ECL显色曝光。

1.6 PP2A磷酸酶活性测定

采用Promega磷酸酶活性测定标准程序，Raji细胞经TGF-β10、15、30、60 min，2、24、48、72 h刺激后采用磷酸酶存储缓冲区收集蛋白，离心(100 000 g，4℃，1 h)；向核酸纯化柱中加入10 mL G-25，自身重力排干，加入10 mL 冷磷酸酶存储缓冲区洗涤核酸纯化柱，自身重力排干，600 g、4℃、离心5 min；加250 μL蛋白样品入核酸纯化柱，用50 mL离心管接住，600 g、4℃、离心5 min；制作标准曲线：取原液20 μL(浓度1 mmol/L)，用无磷水稀释至200 μL，使磷酸盐浓度50 μmol/L，共6个点，每孔加0、2、4、10、20、40 μL，用1×反应缓冲液补齐至50 μL，每样品孔加入5 μL磷酸肽+10 μL 5×反应缓冲液+35 μL上清，37℃孵育30 min，每孔加50 μL钼酸染料，加色法混合终止反应，室温孵育15 min后于630 nm波长处测吸光度值。

1.7 统计学分析

计量资料数据用均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析和t检验。所有实验均重复至少3次。以P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 TGF-β1对Raji细胞凋亡的影响

采用流式细胞术检测TGF-β1不同浓度及不同刺激时间下Raji细胞凋亡情况。1、5、10 ng/mL TGF-β1均能诱导Raji细胞凋亡(均P<0.05)。和5 ng/mL浓度相比，10 ng/mL浓度的TGF-β1作用后凋亡细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)。因此，选择5 ng/mL TGF-β1为凋亡诱导剂量(图1A)。图1B显示，Raji细胞的凋亡率随着TGF-β1作用时间的延长而增加，与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。

无TGF-β1刺激为对照组；与对照组比较，*P<0.05图1 TGF-β1不同浓度和不同时间刺激下细胞凋亡情况Fig.1 Cell apoptosis under stimulation with TGF-β1 of different concentrations and different time

2.2 TGF-β1对Raji细胞Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3表达的影响

为了明确TGF-β1诱导Raji细胞凋亡效应，我们检测了TGF-β1处理前后细胞中Bcl-2、Bcl-xl以及Caspase-3基因表达的变化趋势。RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，5 ng/mL TGF-β1作用于Raji细胞，Bcl-2、Bcl-xl基因表达水平随着作用时间的延长而降低，具有时间依赖性(图2A、2B)；而Caspase-3基因表达水平随着作用时间的延长逐渐增加(图2C)，差异具有统计学意义(均P<0.05)。Western blot检测结果也表明，TGF-β1刺激后Raji细胞Bcl-2、Bcl-xl蛋白随着刺激时间的延长表达逐渐下降，Caspase-3蛋白表达逐渐增多(图3)。

2.3 TGF-β1对Raji细胞ERK1/2总蛋白及其磷酸化水平的影响

Western blot检测各组ERK1/2总蛋白水平，结果显示，和对照组比较，TGF-β1刺激对ERK1/2总蛋白表达水平无明显影响，而其磷酸化蛋白p-ERK1/2随着刺激时间的延长表达逐渐下降(图3)，差异有统计学意义(均P<0.05)。

与control组比较，*P<0.05图2 TGF-β1对Raji细胞Bcl-2(A)、Bcl-xl(B)以及Caspase-3(C) mRNA表达的影响Fig.2 Effect of TGF-β1 on mRNA expression of Bcl-2(A)，Bcl-xl(B) and Caspase-3(C)

图3 Western blot法检测TGF-β1对Raji细胞Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3以及ERK1/2蛋白表达的影响Fig.3 Effect of TGF-β1 on protein expression of Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3 and ERK1/2 detected by Western blotting

2.4 TGF-β1诱导Raji细胞凋亡过程中PP2A活性变化

TGF-β1刺激Raji细胞后，于不同刺激时间点收集细胞蛋白，观察细胞总蛋白磷酸酶活性的改变。结果显示，丝/苏氨酸磷酸酶活性于刺激后15 min开始上升，1 h时达到峰值，随后逐渐下调，差异具有统计学意义(均P<0.05)(图4A)。采用PP2A特异性活性抑制剂OA预处理Raji细胞1 h后，给予TGF-β1刺激72 h，采用Western blot法检测不同浓度OA干预下细胞内Bcl-2、Bcl-xl以及Caspase-3蛋白表达变化。结果显示，OA干预组与TGF-β1组相比，Bcl-2、Bcl-xl表达显著上调，而Caspase-3表达显著下调(图4B)，并且随着OA浓度的增加，干预效应有增强趋势。为进一步明确OA的干预效应，采用流式细胞术检测凋亡细胞百分率。如表1所示，Raji细胞自然凋亡率为(10±3)%，单纯使用OA对细胞凋亡率无显著影响，差异无统计学意义(均P>0.05)；TGF-β1刺激可显著诱导细胞凋亡，其凋亡率为(60±5)%，和对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；采用100、200 nmol/L浓度OA预处理1 h后，可显著抑制TGF-β1对Raji细胞诱导凋亡的作用，其凋亡率分别降至(32±4)%、(25±3)%，和TGF-β1组相比，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

A:PP2A活性随TGF-β1刺激时间变化；B:OA干预对TGF-β1刺激蛋白表达的影响；OA-1:100 nmol/L预处理1 h；OA-2:200 nmol/L预处理1 h；与刺激0min比较，*P<0.05图4 PP2A在TGF-β1诱导Raji细胞凋亡过程中的活性变化及作用Fig.4 Activity change and the role of PP2A in Raji cell apoptosis induced by TGF-β1

分组 72h细胞凋亡比例(%)control10±3100nmol/LOA8±2200nmol/LOA11±35ng/mLTGF-β160±5100nmol/LOA+5ng/mLTGF-β132±4200nmol/LOA+5ng/mLTGF-β125±3

3 讨论

TGF-β作为一种重要的细胞因子，广泛参与胚胎发育、创伤愈合及炎症反应等一系列生理或病理生理过程。TGF-β信号转导包含多种配体与受体的结合。在哺乳动物体内，存在TGF-β1、TGF-β2与TGF-β3等3种配体。而TGF-β受体为受体丝氨酸/苏氨酸激酶两者形成的异源二聚体，包括TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ等3种[6]。研究表明，TGF-β信号通路与肿瘤发生密切相关，它既可以作为肿瘤促进因子，通过增强侵袭性质、影响肿瘤微环境及抑制免疫功能等促进肿瘤转移[7]，也可以作为肿瘤抑制因子，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡[8]。因此，TGF-β信号通路在不同肿瘤、同种肿瘤不同亚型及肿瘤的不同阶段均可产生不同反应，并呈现不同调控机制[9]。研究发现，恶性淋巴肿瘤细胞对内源性TGF-β敏感性降低，但是，通过外源性增加TGF-β剂量仍然可以诱导肿瘤细胞凋亡[5，10]。TGF-β诱导调节肿瘤细胞凋亡的机制根据细胞类型的不同而变化。除TGF-β-Smad这一经典的诱导凋亡途径之外[11-12]，非Smad途径，如Daxx-JNK的活化也可能参与其中[13]。通过上调促凋亡因子的表达(如Bax)和下调抑制凋亡因子的表达(如Bcl-2、Bcl-xl)，诱导产生凋亡信号并激活Caspase家族[14]。Caspase-3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免。

蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核生物体内最为重要的蛋白磷酸酶之一，占细胞总蛋白的1%，在多个信号转导途径中起着重要的调节作用，包括细胞周期调控、细胞增殖、分化以及细胞凋亡[15]。同时，PP2A作为一种重要的肿瘤抑制因子，广泛参与肿瘤细胞的发生和发展。大量研究表明，在多种实体瘤和血液系统肿瘤性疾病中，存在磷酸酶和磷酸激酶的不平衡状态，表现为PP2A磷酸酶活性受到抑制，肿瘤性激酶异常活化，最终引起肿瘤的发生和发展[16]。越来越多的研究证实PP2A在肿瘤中的作用，并且研发出以PP2A为作用靶点的抗肿瘤药物。例如，FTY720是近年来研制出的一种PP2A激活剂，通过激活PP2A，保留其磷酸酶活性，对肿瘤的发生发展具有有效的拮抗作用[17]。相反，采用PP2A特异性抑制剂OA抑制PP2A活性后，能够促进肿瘤的发生[18]。

PP2A通过调节细胞分裂和凋亡信号来发挥肿瘤抑制功能。PP2A的凋亡功能可通过直接去磷酸化一些特异的蛋白来发挥作用，可以同时使抗凋亡蛋白Bcl-2失活而激活凋亡诱导因子Bad；另外，PP2A还可以直接去磷酸化AKT来影响FOX的转录和凋亡活性[19]。在本研究中，我们以B细胞淋巴瘤Raji细胞为研究对象，发现PP2A还能通过去磷酸化ERK1/2发挥促凋亡作用。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一员，受活化的MEK蛋白激酶磷酸化和蛋白磷酸酶去磷酸化作用，前者通过磷酸化激活ER，后者则去磷酸化使其失活。研究发现，磷酸化的ERK(p-ERK)具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。当p-ERK蛋白从细胞质转入到细胞核后，可促进促凋亡基因的表达(如Bad、Bim)和抑制抗凋亡基因的表达(如Bcl-2、Bcl-x1)，最终可激活与凋亡相关的信号途径，如Caspase-3表达上调[20]。因此，PP2A通过去磷酸化ERK，降低p-ERK在肿瘤细胞中的表达，最终达到促进肿瘤细胞凋亡的作用。

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(2016-09-05 收稿)

PP2A-dependent Apoptotic Effect of Exogenous Transforming Growth Factor-β1on Human Burkitt’s Lymphoma Cell Line Raji Cells and Its Mechanism

Zhao Zhe，Liu Li，Liu Kunetal

DepartmentofHematology，MindaHospitalofHubeiUniversityforNationalities，Enshi445000，China

Objective To study the apoptotic effect of exogenous TGF-β1on human Burkitt’s lymphoma cell line Raji cells and its mechanism.Methods Raji cells were treated with recombinant TGF-β1at different concentrations(0，1，5，10 ng/mL)or stimulated by TGF-β1for different time(0，24，48，72 h).The apoptosis rate of Raji cells was detected by flow cytometry.Gene expression levels of Bcl-2，Bcl-xl and Caspase-3 were assayed by real-time PCR.Western blot analysis was used to assay the protein expression level of Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3，ERK1/2 and p-ERK1/2.Protein Ser/Thr phosphatase activity was assayed photometrically using the Serine/Threonine Phosphatase Assay System according to the manufacturer’s directions.Results Cell apoptosis rate was (29±3)%，(47±4)% and (60±5)%，24，48 and 72 h after stimulation of 5 ng/mL TGF-β1(allP<0.05).Simultaneously，mRNA and protein expression levels of Bcl-2 and Bcl-xl were decreased，and those of Casepase-3 were increased with time.Total protein expression of ERK1/2 was not significantly different，but p-ERK1/2 was decreased with TGF-β1stimulation.After pretreatment of 100 and 200 nmol/L okadaic acid(OA)，cell apoptosis rate was significantly decreased [(60±5)%vs.(32±4)% and (24±3)%；bothP<0.05].Conclusion TGF-β1induces Raji cell apoptosis by the activation of PP2A and down-regulation of ERK1/2 signal pathway related genes.

transforming growth factor β1； Burkitt’s lymphoma； apoptosis； PP2A

*湖北省教育厅科研项目(No.B2015101)

赵 哲，男，1979年生，主治医师，硕士研究生，E-mail：1047687209@qq.com

△通讯作者,Corresponding author，E-mail：：yaoping0564@126.com

R733.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.012