CK5在原发性皮肤淀粉样变中表达的病理意义*

邹爱玲，段 铱，曹育春

华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030

CK5在原发性皮肤淀粉样变中表达的病理意义*

邹爱玲，段 铱，曹育春△

华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030

目的 探讨角蛋白5(CK5)在原发性皮肤淀粉样变(PCA)中表达的病理意义。方法 通过CK5单抗检测CK5在39例PCA和10例对照组[扁平苔藓(LP)、皮肤红斑狼疮(LE)]真皮浅层的表达；通过CD3和CD68抗体分别检测T淋巴细胞和巨噬细胞在PCA和对照组真皮浅层的浸润情况；通过免疫荧光共定位方法分析PCA和对照组真皮浅层巨噬细胞吞噬CK5的情况。结果 39例PCA的真皮浅层均见不同程度的CK5阳性；对照组部分为阳性。8例PCA皮损中浸润的T淋巴细胞及巨噬细胞计数均少于对照组；5例PCA皮损中CK5抗体与CD68抗体免疫荧光共定位分析结果为阴性，2例LE均为阳性，2例LP均为阴性。结论 PCA的淀粉样蛋白可能来自界面损伤后的基底层角质形成细胞；淀粉样蛋白的沉积可能与局部的巨噬细胞数量减少或吞噬功能缺陷有关。

原发性皮肤淀粉样变； 淀粉样蛋白； CK5； 巨噬细胞

原发性皮肤淀粉样变(primary cutaneous amyloidosis，PCA)以苔藓样淀粉样变(lichenoid amyloidosis，LA)和斑状淀粉样变(macular amyloidosis，MA)最为常见。其病理诊断主要依据苏木精-伊红染色切片上可见真皮乳头嗜伊红的均一团块状物质及结晶紫或刚果红特染阳性而确诊，而苏木精-伊红染色切片不能发现典型的真皮乳头嗜伊红的均一团块状物质时，往往依据切片上有灶状基底细胞液化变性伴有真皮浅层不等量的噬黑素细胞为线索再做结晶紫或刚果红特染来证实诊断。在病理上典型及不典型的皮肤淀粉样变中，真皮乳头均可见到不等量的淀粉样物质沉积，弄清这种淀粉样物质如何形成对探讨PCA的发病机制无疑有帮助。在典型的PCA中往往见到不同程度的界面改变，或许正是因为这种界面改变引起表皮下部角质形成细胞的损伤而形成真皮浅层淀粉样物质沉积。因此，了解淀粉样物质中是否存在角蛋白情况，有利于阐明PCA淀粉样物质的来源。通常情况下变性的表皮成分脱落至真皮后会被单核巨噬细胞系统所清除。为此，我们将PCA与具有典型的界面改变的扁平苔藓(LP)及皮肤红斑狼疮(LE)进行比较，了解角蛋白5(CK5)在三者真皮浅层中的表达情况及T淋巴细胞及巨噬细胞在三者真皮浅层中的浸润情况，了解在三者中是否存在巨噬细胞吞噬角蛋白的情况。以此来探讨CK5在PCA中表达的病理意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

病例组为同济医院皮肤科2012年1月至2014年7月临床诊断和病理证实为苔藓样或斑状PCA患者。其他类型的PCA(结节型或双相型)、继发性PCA、系统性淀粉样变病、2周内系统应用过糖皮质激素类药物、伴有其他过敏性疾病、患有严重内脏疾病、正在应用免疫抑制剂、免疫功能低下者均不入选。对照组为我科2013年1月至2014年7月临床诊断和病理证实为LP或LE患者。2周内系统应用过糖皮质激素类药物、伴有其他过敏性疾病、患有严重内脏疾病、正在应用免疫抑制剂、免疫功能低下者亦不入选。病例组共入选39例，男21例，女18例；年龄23～75岁，平均年龄(45.9±1.9)岁。对照组10例，5例LP，5例LE；男6例，女4例，年龄23～55岁，平均年龄(40.2±3.3)岁。

1.2 主要仪器及试剂

切片机、普通光学显微镜(Nikon)、激光共聚焦荧光显微镜(日本，Olympus)，鼠抗人CK5单克隆抗体、小鼠抗人CD3、兔抗人CD68，Dako REALTMEnVisionTM试剂盒(均购自博士德生物公司)，TRITC-羊抗兔IgG、TRITC-羊抗小鼠IgG(购自飞羿科技公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫组化 常规组织病理学处理，4 μm连续切片。Envison二步法进行免疫组化检测，以中性树胶封片。

1.3.2 免疫荧光 步骤同免疫组化，加荧光抗体，以DAPI染细胞核，室温暗盒避光10 min。在激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

1.4 观察方法

普通光镜下对CK5染色阳性的蛋白进行观察和半定量分析。①阳性标准：细胞外出现大片状或团块状或颗粒状棕黄色着色为阳性；②位于真皮乳头及真皮浅层；③在光学显微镜放大100倍视野下对阳性强弱分级：阴性(-)，真皮乳头及浅层均未见到阳性蛋白；可疑(±)，真皮乳头似可见少量颗粒状阳性蛋白；弱阳性(+)，真皮乳头见颗粒状或小片状阳性蛋白；阳性()：明显扩张的真皮乳头见团块状阳性蛋白；强阳性()：明显扩张的真皮乳头及真皮浅层均见大片状阳性蛋白。每张切片均经3位专业人员观察，取平均值。

普通光镜下对CD3、CD68染色阳性的细胞进行观察、计数。①阳性标准：以细胞膜、细胞质出现片状或颗粒状棕黄色着色为阳性；②位于真皮浅层浸润细胞；③每张切片选取10个高倍视野(×400)，对每个高倍视野进行计数，取10个高倍视野的均值作为每张标本的阳性细胞数。每张切片均经3位专业人员观察，取平均值。

共聚焦荧光显微镜下，红色荧光为CK5，绿色荧光为CD68标记的巨噬细胞，DAPI染细胞核为蓝色荧光。阳性标准为巨噬细胞的绿色荧光和CK5红色荧光融合后为黄色荧光，否则视为阴性结果。

2 结果

2.1 病例组与对照组真皮浅层或真皮乳头中CK5表达情况

在PCA、LP、LE的HE切片上均见到明显的基底层被破坏，且其下方见不等量的CK5表达，其中PCA的淀粉样蛋白区域CK5容易见到强阳性表达，见图1。

图1 病例组与对照组皮损苏木精-伊红和CK5染色结果(×100)Fig.1 HE and CK5 staining results of the lesions in the case group and the control group(×100)

2.2 病例组与对照组中T淋巴细胞及巨噬细胞在真皮浅层中的浸润情况

三者中均见不等量的CD3+T淋巴细胞及CD68+巨噬细胞浸润，但是，病例组(8例)中真皮浅层浸润的CD3+T淋巴细胞及CD68+巨噬细胞均比对照组(5例LP、5例LE)的少，见图2。

图2 病例组与对照组真皮浅层T淋巴细胞和巨噬细胞的浸润情况和计数(×400)Fig.2 Infiltration and number of lymphocytes and macrophages in superficial dermis of the case group and the control group(×400)

2.3 在PCA、LP、LE中巨噬细胞吞噬角蛋白的情况

病例组(5例PCA)与对照组(2例LP和2例LE)皮损免疫荧光共定位在激光共聚焦显微镜下观察的结果(图3)显示，PCA均为阴性，提示PCA皮损中的巨噬细胞未有吞噬角蛋白的现象；2例LE均为阳性(图3箭头所指)，提示LE皮损中的巨噬细胞能吞噬角蛋白；2例LP结果均为阴性，LP皮损中表达的CK5较少，但巨噬细胞浸润较多，这可能与巨噬细胞已经吞噬并消化了角蛋白有关，致使结果为阴性。

箭头所示为LE患者阳性表现，提示LE皮损中的巨噬细胞吞噬角蛋白图3 病例组与对照组皮损免疫荧光共定位的结果Fig.3 Immunofluorescence colocalization results of the lesions in the case group and the control group

3 讨论

皮肤淀粉样变的淀粉样蛋白成分复杂，至今未完全阐明，仍不断有新的成分报道。已经报道的成分主要有角蛋白(CK)、淀粉样蛋白P物质(AP)、载脂蛋白E(ApoE)及氨基葡聚糖类(GAG)等。近些年新增的有低聚物(oligomers)[1]、半乳糖凝集素-7(Galectin-7)、肌动蛋白(Actin)[2-3]。虽然淀粉样蛋白的成分多样，但是普遍的观点认为角蛋白是PCA(LA、MA型)的主要成分。早在1979年Kumakiri等[4]就提出了变性的角质形成细胞释放角蛋白的观点，随后有一系列关于PCA中角蛋白表达的报道[5-6]。2004年有文献报道[5]首次用单克隆CK5抗体证实了CK5是PCA淀粉样蛋白的主要角蛋白。为此本研究从CK5出发，探讨CK5在PCA中表达的病理意义。

实验结果表明39例PCA皮损中均有CK5的表达。正常情况下，随着表皮向终末分化，角蛋白的表达也发生改变，表皮基底细胞主要表达CK5和CK14，CK5和CK14的表达由下而上逐渐减少，至角质层基本被CK1和CK10所取代。PCA中常常见到界面改变，本研究结果显示在PCA的真皮浅层或真皮乳头的淀粉样蛋白区域有CK5阳性物质，提示淀粉样物质很可能来自因界面损伤后的基底层角质形成细胞。LP和LE真皮浅层亦有不同程度的CK5表达，但在LP和LE的苏木精-伊红染色切片上均未见淀粉样蛋白的沉积。PCA和LP、LE同属界面皮炎，均有CK5的表达，为何只有PCA存在淀粉样蛋白的沉积？为此，本研究进一步比较PCA与LP、LE三者炎性细胞的浸润情况及三者中是否能发现巨噬细胞吞噬CK5的情况。

通常情况下，角蛋白成分进入到真皮会被视为异物成分而被巨噬细胞所清除，由巨噬细胞和真皮成纤维细胞的调理素作用和(或)酶降解介导[7]。实验结果显示8例PCA中均见有一定量的淋巴细胞及巨噬细胞浸润，不过较LP、LE数量少，而免疫荧光共定位方法分析，其结果显示5例PCA中均未发现阳性结果，结合PCA的HE及CK5的免疫组化结果，说明PCA真皮乳头中的CK5不能够被巨噬细胞正常清除。这很可能与巨噬细胞功能存在缺陷有关，导致角蛋白长期滞留在真皮，然后通过某些未知机制，转变成淀粉样蛋白[8]。国内还有检测皮肤淀粉样变皮损中T/B细胞的研究，提示PCA的皮肤免疫机制存在异常[9]。结果还显示2例LE均见到阳性结果，而2例LP均未见到阳性结果。LE的阳性结果提示巨噬细胞能吞噬CK5；LP结果为阴性，可能与巨噬细胞已经吞噬并完全消化了其中的少量CK5有关。以上LP与LE的免疫荧光共定位结果比较分析，提示来自棘细胞层下方或基底层的CK5进入到真皮后，在一定条件下能够被巨噬细胞所吞噬、消化，并被清除。在PCA中淀粉样蛋白的沉积可能与局部的巨噬细胞数量减少或吞噬功能缺陷有关。

综上所述，本研究结果初步证明PCA中的淀粉样蛋白很可能来自因界面损伤后的棘细胞层下方或基底层的角质形成细胞；而淀粉样蛋白的沉积可能与局部浸润的巨噬细胞数量减少或吞噬功能缺陷有关。

[1] Chang Y T，Tsai S F，Wang W J，et al.Role of oligomers in the amyloidogenesis of primary cutaneous amyloidosis[J].J Am Acad Dermatol，2011，65(5)：1023-1031.

[2] Miura Y，Harumiya S，Ono K，et al.Galectin-7 and actin are components of amyloid deposit of localized cutaneous amyloidosis[J].Exp Dermatol，2013，22(1)：36-40.

[3] Ono K，Fujimoto E，Fujimoto N，et al.InVitroamyloidogenic peptides of galectin-7 possible mechanism of amyloidogenesis of primary localized cutaneous amyloidosis[J].J Biol Chem，2014，289(42)：29195-29207.

[4] Kumakiri M，Hashimoto K.Histogenesis of primary localized cutaneous amyloidosis：sequential change of epidermal keratinocytes to amyloid via filamentous degeneration[J].J Invest Dermatol，1979，73(2)：150-162.

[5] Inoue K，Takahashi M，Hamamoto Y，et al.An immunohistochemical study of cytokeratins in skinlimited amyloidosis[J].Amyloid，2000，7(4)：259-265.

[6] Chang Y T，Liu H N，Wang W J，et al.A study of cytokeratin profiles in localized cutaneous amyloids[J].Arch Dermatol Res，2004，296(2)：83-88.

[7] Linser I，Aubock J，Romani N，et al.The keratin body phenomenon[J].Epithelia，1987，1(1)：85-90.

[8] Apaydin R，Gürbüz Y，Bayramgürler D，et al.Cytokeratin expression in lichen amyloidosus and macular amyloidosis[J].Eur Acad Dermatol Venereol，2004，18(3)：305-309.

[9] 许金国，卢宪梅，赵天恩.皮肤淀粉样变性皮损中T/B细胞的检测[J].中华皮肤科杂志，2006，39(10)：582-583.

(2016-11-07 收稿)

Pathological Significance of CK5 Expression in Primary Cutaneous Amyloidosis

Zou Ailing，Duan Yi，Cao Yuchun△

DepartmentofDermatology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China.

Objective To analyze the pathological significance of CK5 expression in primary cutaneous amyloidosis(PCA).Methods The expression of CK5 in superficial dermis of PCA group and the control group[lichen planus(LP)，lupus erythematosus(LE)]were detected by CK5 monoclonal antibody.The infiltration densities of CD3-positive T lymphocytes and CD68-positive macrophages in superficial dermis of PCA and control group were measured respectively by immunohistochemical staining using anti-CD3 antibodies and anti-CD68 antibodies.The skin lesions of PCA and control groups were analyzed by immunofluorescence to detect whether CK5 was phagocytosed by macrophages in superficial dermis.Results Totally，39 cases of PCA all were CK5-positive.Some control cases were positive.The number of CD3-positive T lymphocytes and CD68-positive macrophages in 8 cases of PCA group was lower than that of control group.The result of immunofluorescence colocalization of monoclonal anti-CK5 antibodies and anti-CD68 antibodies in 5 cases of PCA lesions was negative；that in 2 cases of LE lesions were both positive，and that in 2 cases of LP lesions were both negative.Conclusion Amyloid protein may be derived from the basal keratinocytes after interface damage.The amyloid protein deposits may be related to the number decrease or the functional defect of macrophages.

primary cutaneous amyloidosis； amyloid； CK5； macrophages

*国家自然科学基金资助项目(No.81472000)

邹爱玲，女，1981年生，医学硕士，E-mail：70289952@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：963808187@qq.com

R758.6

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.004