乳汁免疫和猪流行性腹泻病毒病疫苗：历史和现状(译文)

译者：吕茂杰 校者：杨保收

仔猪生产

乳汁免疫和猪流行性腹泻病毒病疫苗：历史和现状(译文)

原文出处：Langel Stephanie N,Paim Francine Chimelo,Lager Kelly M,Vlasova Anastasia N,Saif Linda J. Lactogenic Immunity and Vaccines for Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV):Historical And Current Concepts[J].Virus Research,2016,226(11):93-107.

译者：吕茂杰 校者：杨保收

由于肠道病毒感染导致仔猪在发病率、死亡率和生产能力丧失方面的影响，每年给养猪者带来数百万美元的损失。2013—2014年间，猪流行性腹泻病毒（PEDV）病的暴发给美国养猪业带来了9亿～18亿美元的经济损失。被动乳汁免疫被认为是保护新生哺乳仔猪免受PED等肠道疾病危害的最有希望和有效的方法。通过乳汁免疫被动保护哺乳仔猪的效果依赖于病原特异性IgA浆细胞转运至乳腺的数量和乳汁中分泌型IgA的积累程度，这种免疫途径被定义为“肠-乳腺-sIgA轴”。由于胎盘的不可穿透性，新生仔猪处于无免疫球蛋白的状态，对很多的传染性病原体极易感。它们仅依靠来源于母源的初乳和乳汁抗体获得被动保护。先前开发的关于猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）病的活疫苗和灭活疫苗，提供了对母源性免疫和仔猪被动保护机制的理解。在这篇文章中，综述了猪传染性胃肠炎病毒诱导乳汁免疫的研究进展，并指出对当前养猪业正努力控制的猪流行性腹泻病毒感染和相关疫苗的研究方向。同时研究和鉴别出影响乳汁免疫和“肠-乳腺-sIgA轴”的各种因素，有助于改善妊娠母猪预防猪流行性腹泻病毒感染以及改进其它肠道病原用疫苗方案，从而达到提升整个猪群的免疫力、猪群健康和企业生产力的目的。

猪流行性腹泻病毒；猪传染性胃肠炎病毒；乳汁免疫；母源抗体；“肠-乳腺-sIgA轴”；猪

1 前言

20世纪70年代，猪流行性腹泻病毒（PEDV）作为一个新的α冠状病毒，首次出现在欧洲肥育猪群中。随后广泛流行，哺乳仔猪最为严重。然而，从2014年至今，PEDV在欧洲多个国家暴发（Boniotti et al.,2016;Dastjerdi et al.,2015;Grasland et al.,2015; Stadler et al.,2015;Theuns et al.,2015）。在20世纪80年代，由于PEDV在亚洲猪群的暴发，疫病普遍存在，最后成为地方流行性疫病（Song and Park, 2012）。随后，开发出相应的弱毒疫苗和灭活疫苗，并得到广泛应用。然而，从2011年之后，由PEDV强毒株引起遍及整个亚洲的严重的猪流行性腹泻病。在亚洲，来源于欧洲和其它经典PEDV毒株的疫苗无法控制新毒株的致病性（Song and Park,2012）。2013年，PEDV作为一个新的、引起猪群严重腹泻疫病的病原在美国出现。PEDV很快遍及整个美国，感染所有日龄猪只，给养猪场造成巨大的经济损失（Stevenson et al.,2013）。随后，该病传播至加拿大和墨西哥（Jung and Saif,2015;Ojkic et al.,2015）。从遗传学角度分析，美国PEDV毒株与来自于中国的高致病性毒株极其相似（China AH2012 and CH/ ZMZDY/11），但是美国PEDV的起源仍然不清楚（Huang et al.,2013;Marthaler et al.,2013;Vlasova et al.,2014）。PEDV的发生与病程和在20世纪60至80年代引起哺乳仔猪严重流行性腹泻的TGEV相似（Saif et al.,2012）[Saif L J,Proceedings of the 2015 American Association of Swine Veterinarians(AASV) Annual Meeting,page 403-406]。虽然，弱毒猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）疫苗的开发，提供给仔猪一定的保护效应，在1983—1984年TGEV噬呼吸系统型变异株—猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的出现极大地影响了TGEV的流行性和严重性（Pensaert et al.,1986; Saif et al.,2012）。PRCV在美国、欧洲和亚洲的广泛流行，普遍地减弱了TGEV的致病性，TGEV在西欧地区明显减少并消除了其发病率。由于PEDV的高毒力和新生哺乳仔猪不成熟的免疫系统，被动的乳汁免疫对哺乳仔猪的保护是最关键的。其被动免疫作用发生类似于TGEV的乳汁免疫，其中“肠-乳腺-sIgA轴”在针对PEDV的乳汁免疫中扮演关键角色（Bohl et al.,1972）。弄清楚“肠-乳腺-sIgA轴”循环对于保障PEDV暴发期间的猪群健康至关重要，便于设计开发预防性疫苗。在这篇综述中，我们主要关注引起哺乳仔猪致命的PEDV病原的乳汁免疫和疫苗的设计。了解TGEV的乳汁免疫的诱导机理，将给PEDV疫苗的开发提供历史性的见解。

2 乳汁被动免疫和“肠-乳腺-sIgA轴”

PEDV和TGEV主要感染部位为小肠，通过血清病毒核酸的检测表明病毒感染幼龄仔猪存在短暂的病毒血症（Jung et al.,2014）。对新生仔猪的感染尤为严重。对两种病的免疫策略必须通过诱导黏膜免疫来达到阻止猪小肠上皮细胞靶向病毒的感染。对于新生和哺乳期仔猪来说，黏膜免疫的保护水平是必要的。对新生仔猪感染猪流行性腹泻病毒的预防存在两种主要问题：1）在阳性母猪群，母源抗体干扰口服活疫苗诱导的免疫保护；2）对于仔猪，需要3周的时间产生抗体。因此，在怀孕母猪黏膜部位诱导产生的免疫应答，通过初乳和乳汁被动转移给仔猪，提供给仔猪肠道感染的直接保护作用至关重要。先前对于TGEV被动免疫的研究表明，感染TGEV康复的母猪能够提供给其后代猪群针对TGEV感染的保护。这种保护与乳汁中高水平的抗体息息相关，而不是血清中抗体（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif, 1975;Saif et al.,1972）。然而，对于乳汁免疫和诱导乳汁抗体保护水平的机制还不清楚，这也阻碍了有效TGEV母源抗体疫苗的开发。同时，肠道病原的乳汁免疫诱导作用机制相关问题的不清楚，也影响了PEDV疫苗的效果。早期对TGEV疫苗的研究发现了几种关键的免疫学想象（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。由于母猪胎盘的不可通透性，仔猪天生无免疫球蛋白，仅依靠初乳和乳汁抗体来获得被动免疫保护（Saif and Jackwood,1990）。这也使得仔猪对过多的病原感染表现出高的易感性。对于母猪，在初乳中IgG为优势抗体，主要从血清中渗出（Klobasa et al.,1987），新生仔猪通过哺乳获得初乳抗体（主要为IgG）。这些免疫球蛋白仅能在仔猪出生后的24～48 h时间内通过小肠上皮转运，在接下来的2～3 d，初乳过渡至乳汁阶段，起主导作用的sIgA通过泌乳持续存在于乳汁中。因此，从母猪初乳中获得的IgG抗体提供给仔猪的血清抗体反映了母猪血清抗体的特异性，用于预防仔猪的系统性感染；IgA抗体在乳汁中占优，提供给仔猪针对肠道病毒感染的被动免疫保护作用。揭示乳腺中分泌sIgA抗体至乳汁的IgA免疫细胞的来源，对于诱导被动乳汁sIgA抗体保护的肠道相关疫苗的设计尤为重要。除了乳汁，在黏膜表面和大多数黏膜分泌物中，sIgA是主导的免疫球蛋白（Macpherson et al., 2008;Mantis et al.,2011）。sIgA对蛋白酶的抵抗力保障了其在胃肠道的高稳定性。对于TGEV免疫的研究，提供了对怀孕猪乳汁免疫策略的基本理解。1972年，Bohl等在猪中发现的“肠-乳腺-sIgA轴”（IgA免疫效应细胞从肠道向乳腺穿梭）是关于黏膜免疫系统概念的最早定义（Bohl et al.,1972;Saif, 1999;Saif and Bohl,1983;Saif et al.,1972;Weisz-Carrington et al.,1978）。研究结果揭示了自然感染或者口服接种TGEV母猪和感染后康复母猪，乳汁中含有持续高水平的sIgA抗体，保护仔猪免受TGEV的感染。然而，使用灭活疫苗免疫母猪在血清和初乳中主要是IgG抗体，在乳汁中迅速下降，提供给仔猪很少的乳汁免疫。这种发现也使得诱导黏膜被动免疫的母源的免疫策略适用于多个物种和肠道病原，包括PEDV。

2.1 猪群中淋巴细胞黏膜归巢的基本要素

淋巴细胞在血液和淋巴组织之间不断循环至全身各系统，发挥对入侵病原的免疫监视和保持内环境稳定的作用（Butcher and Picker,1996;Gowans, 1959）。淋巴细胞通过毛细血管后微静脉血管在二级淋巴器官中迁移，从而出入二级淋巴器官。T淋巴细胞和B淋巴细胞经高内皮小静脉血管渗出，经过多步加工，包括滚动、黏附、迁移和定位至各自的淋巴结（Kunkel et al.,2003;Springer,1995）。淋巴细胞和内皮细胞差异化表达表面配体和受体，趋化因子和细胞因子可辨别来自黏膜归巢位点的外周淋巴细胞。系统性的淋巴细胞归巢和黏膜部位的淋巴细胞归巢的不同有助于对黏膜免疫反应和针对系统性病原或黏膜性病原疫苗设计的理解。比如，淋巴细胞配体α4β1，L-选择素（L-selectin）和细胞因子受体（CCR）7分别与血管细胞黏附因子1（VCAM-1），外周淋巴结黏附素（PNAd）和细胞因子配体（CCL）21相互作用来控制淋巴细胞的外周迁移（Miyasaka and Tanaka,2004）。然而，淋巴细胞穿梭定位至黏膜组织，尤其是小肠，大多是通过α4β7与黏膜黏附细胞黏附分子1（MAdCAM-1）相互作用来调控的（Briskin et al.,1997;Marui et al.,1993）。由高毛细血管后微静脉和其它组织分泌的细胞因子在黏膜淋巴细胞迁移和限定归巢部位（比如：淋巴细胞穿梭的组织特异性）中扮演重要的角色（Miyasaka and Tanaka,2004）。趋化因子通过结合细胞表面的G蛋白偶联受体，抑制腺苷酸环化酶，活化细胞内钙离子来调节淋巴细胞的直接迁移（Dixit and Simon, 2012）。受体活化后，趋化因子结合到淋巴器官或其它组织的膜链和细胞外基质相关的葡糖氨基聚糖类来产生趋化因子成分（Proudfoot et al.,2003）。在小肠，内皮细胞分泌的CCL25和CCL28，分别结合淋巴细胞分泌的CCR9和CCR10（Stenstad et al.,2006; Wang et al.,2000;Wurbel et al.,2007）。

据估计，超过80%IgA抗体分泌细胞（ASC）位于肠相关淋巴组织中（Suzuki et al.,2007；Macpherson and Slack,2007）。因此，在猪体中，黏膜B细胞有效迁移的特殊穿梭信号的启动，对肠道疾病的预防和清除是必需的。例如，在对肠道病原轮状病毒的小肠感染过程的研究中，病毒仅存在很短的时间窗口（首次感染4～9 d，二次感染3～7 d），此时可在血液中检测到肠来源的淋巴细胞和IgA抗体分泌细胞的运输。这些细胞在血液中短暂的运输表明其在肠道受到的刺激，并且归巢至小肠和其它黏膜部位（Brown et al.,2000;Ward et al.,1996b;Yuan et al.,1996）。这些研究结果表明在猪体中识别运输信号启动窗口期和淋巴细胞受刺激后由肠道进入循环，运输至其它黏膜部位的时间窗口期的重要性，比如乳腺。此外，就像在小鼠肠道中出现的α4β7+记忆性B细胞与轮状病毒的清除相关联，归巢标记物α4β7可能对于PEDV的清除也是有用的（Williams et al.,1998）。

Bourges和同事分析了猪体内不同黏膜部位黏附分子和细胞因子差异化表达情况（Bourges et al., 2007）。相比α4β7，α4β1在黏膜固有层、上皮内CD3T和IgA B淋巴细胞中的表达高于在鼻黏膜和外周血淋巴细胞。然而，在小肠上皮内CD3T和IgA B淋巴细胞中α4β7的表达高于α4β1。在鼻和小肠黏膜表达不同通过测量血管黏附素来确定。PNAd在鼻黏膜固有层的血管表达，而在小肠血管未检测到。相反，MAdCAM-1在小肠中检测到表达，而在鼻黏膜固有层不表达。相比小鼠和人类，在猪体内，这些结果提示黏膜归巢特性存在组织特异性（Butcher and Picker,1996）。此外，黏膜细胞因子及其相关受体的表达也表现出组织特异性。CCL25在呼吸道组织中展现低水平的mRNA表达，而在小肠中表现高水平的表达。在小肠、大肠和气管存在CCL28的高水平表达。当猪体小肠和呼吸道组织中CCR9的表达普遍存在时，高水平表达的CCR10定位到小肠和大肠、肠系膜淋巴结和乳腺。评估健康猪体和感染猪体中黏附分子和细胞因子的角色对于理解发病机制和宿主免疫反应是不可或缺的，有助于开发更有效的疫苗。了解淋巴细胞转运及其相关信号有助于进一步理解肠道病原（如PEDV）的免疫反应。通过优化疫苗效果，使其靶向猪体小肠淋巴细胞对黏膜转运最大效应期，将会增强乳汁免疫，从而减少新生哺乳仔猪的发病率和死亡率。

2.2 在母猪中IgA浆细胞从小肠到乳腺的归巢

有关于通过对怀孕动物的免疫提供给哺乳仔猪被动保护，从而免受细菌和病毒感染的研究（Bohl et al.,1972;Bohl and Saif,1975;Bohl et al.,1974;Kortbeek-Jacobs et al.,1984;Lanza et al.,1995;Moon and Bunn,1993;Saif et al.,1972;Saif and Fernandez, 1996;Saif et al.,1984;Wilson et al.,1972）。乳汁免疫即通过消化初乳和乳汁来获得免疫球蛋白（IgG、IgM、sIgA）的连续供应过程，在初乳中IgG为优势型，乳汁中IgA为优势型（Klobasa et al.,1987）。在肠道分泌物中最大量的抗体为sIgA，其通过借助上皮细胞底外侧表面的多聚免疫球蛋白受体将小肠浆细胞产生的二聚体IgA迁移至肠腔来产生（图1）。一旦进入肠腔，sIgA即可提供免疫保护，促成小肠的内环境稳定（Macpherson et al.,2008;Mantis et al., 2011）。“肠-乳腺-sIgA轴”通过小肠的自然感染或口服免疫来启动后，浆母细胞以泌乳的方式运输至乳腺提供特异性免疫。小肠中IgA浆母细胞和T细胞的迁移主要是通过表面整联蛋白α4β7与MAd－CAM-1，CCR9与CCL25，CCR10与CCL28的相互作用来介导。然而，在小鼠中，归巢标记一致的显示为CCR10和CCL28的相互作用，通过二者的相互作用来调控IgA浆母细胞的迁移；当CCL28被阻断，乳汁中IgA抗体水平减少，从而导致了乳鼠摄入性IgA抗体的缺乏（Wilson and Butcher,2004）。此外，在CCR10缺陷的鼠模型中，IgA抗体分泌细胞在乳腺的积累功能丧失（Morteau et al.,2008）。这些研究在猪体内未被复制，但存在相关的证据。在小鼠和猪泌乳前，CCL28在乳腺中最大量的表达（Berri et al.,2008;Lazarus et al.,2003）。在母猪的整个妊娠过程中，乳腺中CCL28蛋白量和积累的IgA B细胞的数量同时增加（Bourges et al.,2008;Meurens et al.,2006）。另外，CCL28蛋白在母猪乳汁中被检测到，进一步证实在母猪乳汁免疫中该细胞因子的重要角色（Berri et al.,2008）。

在母猪的妊娠末期和哺乳早期，乳腺血管内皮细胞表达MAdCAM-1增加（Bourges et al.,2008）。在猪和小鼠中，当α4β7与MAdCAM-1结合提示募集IgA浆母细胞到乳腺，同时也存在相反的结论（Postigo et al.,1993;Tanneau et al.,1999）。在小鼠，α4β7结合MAdCAM-1的功能阻断，乳汁IgA的蓄积未减少（Low et al.,2010）。而且，在猪体中，迁移进入乳腺的IgA浆母细胞仅有小部分IgA B细胞在乳腺中表达α4β7(Bourges et al.,2008）。这些结果表明尽管α4β7/MAdCAM-1相互作用在“肠-乳腺-sIgA轴”中起重要作用，但同时也存在其它的作用机制。然而，在小鼠中，整联蛋白α4β1和各自的地址素VCAM-1（addressin VCAM-1）与淋巴细胞到乳腺的迁移相关。在猪体中，泌乳期乳腺中检测到表达α4β1的IgA B细胞，数量上高于表达α4β7的IgA B细胞。此外，血管细胞黏附素（VCAM-1）在乳腺的表达先于分娩和泌乳期间（Bourges et al.,2008）。当小鼠用抗VCAM-1血清处理，IgA抗体分泌细胞在泌乳乳腺的蓄积被抑制（Low et al.,2010）。这些数据表明抗体分泌细胞在小鼠体内的运输依赖于α4β1/VCAM-1的相互作用。小鼠和猪之间的不同报道要考虑淋巴细胞结构的物种差异（Rothkotter,2009）。需要进一步猪体内的研究来确证从小鼠研究中获得的结果。

分析乳腺组织和分泌物中B细胞、T细胞和趋化因子来监视免疫细胞到乳腺的运输特征。在整个怀孕期，乳腺中B/T免疫细胞组成和积累呈现动态过程，与CCR10和CCL28 mRNA的表达水平呈现平行关系。比如，在妊娠早期（妊娠期前3个月），乳腺中IgA B细胞和T细胞数量较少，同时CCR10/CCL28表达几乎没有；在妊娠中期，乳腺中T细胞数量增加，而IgA B细胞数量与妊娠前期相同；妊娠晚期，乳腺中T细胞的蓄积达到峰值，而IgA B细胞数量和CCR10/CCL28表达适度的增加。在动物分娩时间，IgA B细胞数量达到峰值，在泌乳期，CCR10/CCL28表达持续增长（Bourges et al.,2008;Chabaudie et al., 1993;Meurens et al.,2006）。这些结果表明B细胞运输对于乳腺免疫的重要性，随后抗体分泌至初乳和乳汁中。了解怀孕后期免疫细胞迁移至乳腺的动力学特征，对于乳汁免疫的调节是必不可少的。通过自然感染或口服接种来启动未感染母猪的“肠-乳腺-sIgA轴”，需要优化病原特异性B细胞、T细胞和其它影响因素，包括胎次、妊娠阶段、乳素和乳腺发育的激素、暴露剂量（本部分内容仅提出概念，未全翻译）。

图1 关于“肠-乳腺-sIgA轴”和转运分子的示意（Chattha et al.,2015）

3 母猪乳汁免疫相关的物质

3.1 IgA抗体

鉴定感染或免疫相关物质便于评估个体动物或群体的易感性，便于理解感染/接种疫苗、宿主免疫反应、临床症状和免疫保护之间的关系。关于乳汁免疫，母猪通过母源抗体来提供给新生仔猪免疫保护是最好的例证（Saif,1999;Zinkernagel,2001）。已有记录表明由于胎盘的不可透过性母猪生出无免疫球蛋白后代（Kim et al.,1966）。通过乳汁免疫提供给仔猪免疫防御需要的母源抗体持续到仔猪可以产生足够数量的内源性抗体阶段。先前在猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的研究中鉴定了免疫相关物质。其中，新生仔猪对TGEV保护率的增加与初乳和乳汁中高滴度的sIgA抗体相关（Bohl et al.,1972; Bohl and Saif,1975;Saif et al.,1972）。此外，在人轮状病毒诱导疾病模型中，首次鉴定出血液和小肠中IgA抗体分泌细胞穿梭，IgA抗体分泌细胞作为一种免疫保护标记，活化肠道免疫。在这项研究中，血液中轮状病毒特异性的IgA抗体分泌细胞，而不是IgG抗体分泌细胞，与小肠IgA抗体分泌细胞相关，可抵抗同型病毒的攻击（Yuan et al.,1996）。这种关系在新生儿病人中被证实，循环的轮状病毒特异性IgA抗体分泌细胞与小肠固有层IgA抗体分泌细胞相关（Brown et al.,2000）。从肠到其它黏膜组织细胞穿梭的特定时间范围，通过评价SPF猪只经过轮状病毒攻击后，小肠（肠系膜淋巴结和回肠固有层）、循环（血液）和系统（脾脏）单核细胞的淋巴细胞增殖反应来确定。轮状病毒接种或攻击早期，血液中轮状病毒特异性淋巴增殖反应与小肠中淋巴增殖反应相关。而且，大量的淋巴增殖反应与轮状病毒特异性分泌抗体细胞相关，这也支持淋巴细胞增殖量化协助刺激B细胞产生抗体的Th细胞穿梭的假说（Ward et al.,1996a;Yuan et al.,1996）。

这些研究表明了在PEDV感染的后备母猪和经产母猪的血液中免疫细胞和抗体分泌细胞从肠到乳腺穿梭窗口期的重要性。小肠黏膜免疫相关的免疫因子，像sIgA，是重要的免疫相关物。关于PEDV，近期的研究表明接受被动乳汁免疫的仔猪，保育猪的排毒量明显减少。检测的仔猪粪便中病毒RNA的载量与乳汁IgA抗体水平之间呈线性关系。仔猪获得高滴度的IgA抗体，其粪便中检出明显低的PEDV RNA载量。IgA抗体在乳汁免疫和新生仔猪的PEDV被动保护中起到重要作用（Poonsuk et al., Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 47）。近期的研究表明系统性的抗体提供抗PEDV的保护（Poonsuk et al.,2016）。在这项研究中，2～5日龄新生仔猪分别腹膜内注射不同浓度的抗PEDV血清抗体，24 h后接种PEDV病毒，由于循环系统中PEDV抗体的存在，攻毒仔猪很快恢复至正常体温，表现出较PEDV抗体阴性仔猪攻毒后更小的死亡率。然而，通过腹膜内的抗血清抗体的注射，仔猪的生长率、PEDV粪便排毒和体液免疫反应未提高。系统性抗体在PEDV的清除中起到重要的作用，对新生仔猪保护作用最大的是乳汁中母源sIgA。

近来进行的一项免疫效果评价试验，在生产单元将即将死亡新生仔猪的小肠返饲给母猪，同时使用商品化疫苗做平行口服免疫，进一步支持上述假设。在第1个生产单元A，无PEDV感染的后备母猪和母猪在产前6周和3周分别肌肉注射Harrisvaccines公司PEDV疫苗（iPED）；该疫苗基于α病毒表达载体技术通过使用重组马动脉脑炎病毒（VEE）TC-83株复制子表达PEDV S糖蛋白来制备。包裹PEDV S RNA的重组VEE病毒颗粒通过感染的Vero细胞收获，VEE表达S基因的复制子RNA用于疫苗中（Kim et al.,2016）。在生产单元A中，免疫后备母猪和母猪产生低水平或可忽略的血清PEDV IgG抗体和乳汁PEDV中和抗体滴度。第2个生产单元B，后备母猪和经产母猪在PEDV暴发初期于产前4个月进行返饲免疫，这些免疫动物乳汁中产生高滴度的PEDV中和抗体，但在血清中未检测到PEDV IgG抗体。第3个生产单元C，生产母猪在农场PEDV暴发初期，给予连续3 d的返饲免疫，之后分别在血清和乳汁中检测到PEDV中和抗体和IgG抗体。这些结果表明乳汁PEDV中和抗体滴度的成功产生，依赖于生产母猪的经口暴露或口服免疫，血清IgG抗体滴度可能与PEDV的免疫不相关（Bohl et al.,1972; Saif and Bohl,1979;Saif et al.,1972）。Scherba和同事在两次PEDV暴发期间，针对第4个生产单元D，平行进行了产前9周和2周的PEDV免疫和产前8周和2周的返饲免疫，生产单元D生产后经历第3次的PEDV暴发。在生产单元D中的后备母猪和生产母猪血清PEDV IgG抗体水平超过4周后即减弱，与乳汁中PEDV中和抗体水平不一致，这也表明了针对PEDV的血清IgG抗体和乳汁PEDV中和抗体滴度之间缺乏相关性（Scherba et al.,2016）。同时设置的对照单元，3头后备母猪既不免疫也不感染，单独隔离饲养，与上述分组在相同时间点进行采样。这项研究中，缺少对血清和乳汁中PEDV IgA抗体水平的分析，缺乏对随后PEDV暴发的仔猪死亡率和保护率的报道，因这项研究在生产猪群进行，仔猪攻毒研究不可能开展。有必要注明：因为生产单元B-D经历过PEDV暴发，外加返饲免疫，使得每个生产单元的动物摄入不同剂量PEDV，其中病毒量依赖于生产单元管理实践和环境病毒载量；作者阐述生产单元A是无PEDV感染，无血清学数据来证实。

3.2 中和抗体、PEDV疫苗和仔猪被动保护

病毒感染后产生中和抗体，抗体多变区的抗原结合位点必须结合与病毒中和相关的抗原表位。抗体中和的机制包括病毒感染周期各部分的抑制作用，包括细胞表面结合、融合、穿入、胞吞作用、病毒在细胞内的复制（Klasse and Sattentau,2002）。对于一些获批的疫苗产品，中和抗体与疫苗效力质量相关（Zinkernagel,2001）。PEDV为α病毒，包括至少7个ORF，编码4个主要的结构蛋白，S（Spike）蛋白，E（envelope）蛋白，M（membrane）蛋白，N（nucleocapsid）蛋白和由ORF3基因编码的辅助蛋白（Huang et al., 2013）。S蛋白形成棘突，位于N蛋白外围，包含两个结构域S1和S2。S1结构域与宿主细胞受体结合相关，S2蛋白介导病毒的膜融合和穿入细胞（Bosch et al., 2003;Sturman et al.,1985;Wicht et al.,2014）。对于TGEV而言，S1结构域是病毒中和抗体的有效诱导部位，对仔猪的保护至关重要。对于PEDV S1蛋白的研究表明S1D（aa636-789）结构域与PEDV抗血清反应，引起小鼠产生PEDV中和抗体（Sun et al., 2007）。此外，使用S1蛋白的特异性卵黄抗体IgY口服免疫新生仔猪可获得对PEDV攻击的保护（Kweon et al.,2000）。然而，由于缺少使用非特异性抗体IgY免疫后攻毒对照，非免疫IgY是否也介导被动免疫保护并不清楚。S1蛋白诱导中和抗体的能力，在不同的冠状病毒之间是保守的，包括β冠状病毒属SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome coronavirus)(Sui et al.,2004;Yu et al.,2015)。S1蛋白刺激中和抗体产生的能力使其可作为PEDV肠道免疫启动后的加强疫苗使用（Park et al.,1998）。sIgA通过结合PEDV S蛋白胞外结构域（受体结合亚单位S1和膜融合亚单位S2）来抑制病毒细胞穿入和感染。因此，在新生仔猪肠腔中足量sIgA对于预防PEDV感染和致死非常重要。DR13株疫苗经口服途径较肌注途径免疫母猪提供给仔猪更多被动保护效果（仔猪死亡分别为13%和60%）（Song et al., 2007）。该研究结果表明了“肠-乳腺-sIgA轴”循环。经口服途径较肌注途径免疫分娩阶段怀孕母猪，其血清中表现出增加的PEDV IgA抗体水平。两种免疫途径免疫母猪的血清中和抗体滴度无差异。口服途径免疫的母猪较肌注途径免疫的母猪表现出初乳中增加的PEDV中和抗体滴度。初乳中增加的PEDV中和抗体滴度与血清中增加的IgA抗体相关，口服途径免疫母猪后所产3日龄仔猪血清中展现增加的中和抗体滴度。这些结果表明针对于DR13株疫苗来说，通过口服途径诱导的母猪初乳或乳汁中和抗体滴度可更好的反映仔猪保护效果。比起系统性的抗体水平，与保护性免疫相关的初乳/乳汁抗体是更合理决定疫苗效果的诊断工具。

3.3 抗体分泌细胞

先前描述到，肠源的IgA ASC在血清中短暂运输，可能是与肠感染免疫相关。选2组仔猪分别用PEDV强毒株和弱毒株免疫，仅强毒株免疫仔猪在血液、小肠和脾脏中诱导产生特异性ASC。经PEDV攻毒后，使用强毒株免疫仔猪较弱毒株免疫仔猪在肠道中产生增加的IgG抗体和IgA ASC。在肠淋巴组织和血液中抗体分泌细胞（ASC）和保护之间存在强的正相关性（de Arriba et al.,2002）。在临床中，怀孕母猪PEDV感染后1个月肠道中检测到IgA和IgG PEDV特异性ASC。在PEDV暴露6个月后，母猪肠道中ASC数量减少但仍可检测到（Ouyang et al.,2015）。然而，近期研究未在血液中检测到PEDV特异性ASC穿梭。此外，在不同农场饲养的已被PEDV感染动物，可能在初次感染和屠宰的时间段再次受不同剂量的PEDV感染。在可控的环境条件下，需要进一步检测感染动物和PEDV攻毒仔猪的乳汁免疫和死亡率。还需要进一步血液分析来证实血清PEDV特异性ASC与乳汁保护的相关性。

4 预防流行性PEDV和TGEV的疫苗免疫策略

通过母源免疫策略诱导乳汁免疫来抑制TGEV感染的策略（Saif,1999;Saif et al.,2012）（Saif L J, Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。可应用于新出现的PEDV感染。总结前期研究成果，仅使用弱毒口服TGEV疫苗经过多倍剂量接种怀孕母猪（通常在产前5～6周和2～3周进行2次接种）诱导乳汁中产生sIgA抗体和变化的被动保护率。然而，弱毒株免疫母猪较强毒株免疫母猪产生较低的乳汁sIgA抗体水平和仔猪保护率。导致差异原因包括疫苗中较低的病毒量和胃肠道稳态的丧失，以及病毒致弱后在母猪肠道复制能力。在免疫母猪所产仔猪TGEV攻毒保护研究中，如果疫苗在母猪肠道中诱导主动免疫失败，母猪发病，表现腹泻或食欲减退和停止乳汁产生，哺乳仔猪表现高死亡率（Saif et al.,2012）（Saif L J,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 403-406）。因此，诱导有效黏膜免疫的TGEV或PEDV母源疫苗对于保护母猪肠道是至关重要的。先前提到，使用灭活TGEV疫苗经非口途径免疫不能诱导黏膜免疫，在血清和初乳中主要是系统性的IgG抗体占主导地位，其在乳汁中很快下降，提供给仔猪微不足道（很小）的乳汁免疫。例外的是，如果血清中诱导产生的高水平IgG抗体渗入初乳中，其在乳汁中高水平维持可保护新生仔猪度过第1周。通过肌注灭活或活的PEDV疫苗是否能够刺激母猪产生针对PEDV的足够免疫保护，Paudel等（2014）在母猪中评价了4组疫苗组合的免疫效果，包括非免疫对照组，灭活疫苗免疫组（两次免疫，K/K），活疫苗免疫组（两次免疫，L/L）和活疫苗、灭活疫苗免疫组（活疫苗首免，灭活疫苗加强免疫，L/K）。所有免疫采用肌注途径，分别在产前4周和2周进行。母猪经ELISA抗体检测和RT-PCR检测为PEDV阴性（粪便检测）。研究表明：K/K组母猪血清、初乳和仔猪血清中有更高的IgG和IgA抗体滴度和中和活性，L/L组水平最低。由于活疫苗的肌肉注射途径，病毒不太可能到达肠道，从而在大多数母猪的小肠上皮细胞复制。这项研究结果可提供关于疫苗免疫原性的资料，但是不能反映经口途径感染PEDV后的免疫反应。此外，还需要进行仔猪PEDV攻毒保护试验来确证K/K免疫组提供给仔猪充足的乳汁免疫和对发病仔猪的有效保护（Paudel et al.,2014）。

4.1 关于母源疫苗设计和返饲途径中IgA免疫细胞从肠到乳腺靶向归巢的实际情况

IgA免疫细胞从肠至乳腺归巢的时间和机制，与疫苗免疫方法，猪群免疫状态的相关性，尚存在许多未解问题。关于使妊娠母猪产生足够乳汁免疫的最佳疫苗免疫时间或间隔的研究很少。也没有关于经产母猪和后备母猪的疫苗免疫反应比较的详细研究。对于经产母猪和后备母猪来说，妊娠期间“肠-乳腺-sIgA轴”何时启动是一个重要问题，青春前期后备母猪是否能通过暴露于病毒后诱导。在第一项研究中，使用US PEDV分离毒株进行试验，使用自然感染PEDV SINDEL弱毒株猪群的4头母猪（平均胎次5.4），农场中母猪自然感染临床分离的活病毒株。7个月后，这些母猪转入隔离设施，在妊娠109 d，试验条件下再次接触更强的PEDV分离毒株。产后3日龄仔猪，给予口服接种强毒，记录攻毒后4 d内仔猪的存活情况。在PEDV阳性猪群组，攻毒后所有仔猪全部存活，无感染猪群组攻毒后死亡率为33%（Goede et al.,2015）。这个研究表明：猪场经产母猪能够产生乳汁免疫，但是攻毒仔猪保护效果不完全，在4窝猪中变化不定，这也提示有许多影响因素。新近报道，研究者对接触病毒后母猪进行了至少5个月PEDV血清抗体滴度检测。有必要对性成熟或妊娠前后备母猪感染PEDV后所产仔猪进行攻毒保护试验，以便确定后备母猪和经产母猪乳汁免疫的诱导效果和仔猪被动免疫的相关性（Schelkopf et al.,Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting,page 309）。另一个重要问题，在后备母猪/经产母猪肠道中病毒复制的剂量和区域如何影响乳汁中IgA抗体诱导，是否乳汁IgA抗体对预防仔猪PEDV感染足够。如同在TGEV疫苗研究中阐述，在设计母源疫苗和返饲方式时，应该考虑到经产母猪肠道PEDV复制，或者使用PEDV弱毒疫苗，要考虑诱导中和抗体产生抗原的稳定性和免疫原性。

4.2 猪群PEDV状态

根据PEDV感染，抗体水平和临床症状，可将猪群分成3种状态。PEDV阴性猪群为无PEDV感染；PEDV活动猪群为RT-qPCR检测到病毒并表现临床发病猪群；PEDV稳定猪群为之前感染过PEDV，之后不表现临床疾病，基于RT-qPCR检测的PEDV粪便检测为阴性，部分或全部母猪PEDV抗体阳性。在美国PEDV感染的第4年初，PEDV活动猪群可能是在流行早期之前感染猪群。其临床疾病没有首次感染猪群广泛，表明PEDV首次感染猪群中经产母猪的母源免疫缺乏（Goede and Morrison,2016）（Proceedingsofthe2016 AASV Annual Meeting:Hough, S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。从2013—2014年年底之后，在美国新发PEDV病例明显减少，但仍出现PEDV阴性猪群首次感染的偶发病例，如同在2013年首次报道一样，猪场经历明显的经济损失（https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animal health/animal-disease-information/swine disease-information/ct_ped_info）。对猪群不同状态的描述可为针对PEDV的控制策略提供一定依据。然而，由于美国大多数猪采用多点式生产方式饲养，这些猪来源于包括超过1 000头共舍的经产母猪场。此外，在一些饲养点，大的母猪舍分布密集。相反，更多传统的生产-肥育饲养场，在其所有饲养点上包含相对少量的母猪数量。在猪群饲养管理方面的多样性导致了多个猪病的混合感染流行，对于PEDV来说，这种情况尤其受影响。

4.3 返饲方法

起初，通过将整个猪群暴露于污染材料或返饲（如感染仔猪粪便和肠组织）的方式来激发PEDV的主动免疫，从而达到控制PED的目的（https://www. aasv.org/）。使母猪产生针对PEDV的免疫保护，且通过初乳或乳汁转移给仔猪，使仔猪在最易感染阶段，获得有效保护。从临床发病率明显下降角度来看，返饲策略似乎起到很好作用，但并不是100%有效（Goede and Morrison,2016）。返饲实践中，减少或消除临床疾病过程产生的明显不足是控制感染后母猪免疫的持续时间和质量问题。此外，将大量猪群暴露于病毒所带来的问题，返饲用生物材料的质量问题，返饲人员实际操作存在的问题。涉及多种返饲的改进策略，在确保所有母猪至少1次暴露给感染病毒的目标下，在超过2周时间内，使所有经产母猪返饲2～3次（https://www.aasv.org/pedv/Conceptsforherdexposure 121713.pdf）。这种方式明显改善了一些猪场条件，但仍有低水平临床病例报告，这也说明一些繁殖猪群通过返饲方式来获得免疫并不可行。或者，尽管母猪用感染野毒的方式获得免疫，但仔猪仍然受侵袭，原因为：1）母猪免疫的持续期或等级不够；2）临近生产阶段，返饲使用的病毒致病性太强导致经产母猪在产房大量病毒所致。这些结果突出显示了对母猪乳汁免疫影响因素和哺乳仔猪被动免疫保护相关因素了解缺乏。返饲失败也可能与弱毒疫苗有相似的问题：1）病毒含量太低；2）材料的不当储存；3）猪体已有的免疫阻断了肠道中病毒复制；4）妊娠阶段返饲时间的选择影响了乳汁免疫效果（Ackerman M,Proceedings of the 2015 AASV Annual Meeting,page 421）。

4.4 猪群大小影响PEDV感染的持续性

随着US PEDV流行进行第4年，发表了很多的临床病例报告（Goede and Morrison,2016）（Proceedings of the 2016 AASV Annual Meeting:Hough,S,page 358-359,Thomas,P,page 360-362）。有研究表明在疫病暴发的急性期，返饲策略帮助许多的农场减少了损失，其对将来疾病的发生起到了预防作用（比如，PEDV稳定猪群）。然而，也有一些农场返饲实践中存在控制疾病的困难期（PEDV活跃猪群）。小猪群的阴性状态可能归咎于较少污染的运输工具、工人衣服和输入猪群。较小猪场比起大型猪场，工人易于监督管理，地理位置上更容易分隔开，大猪场相对更集中。

现阶段，在美国无PEDV感染猪群反映了其严格坚持的生物安全实践；PEDV稳定猪群表明感染猪群如何消除PEDV和维持无病毒感染；PEDV活跃猪群通常是单个疫点大群发病，从农场中消除病毒很困难。这种地方流行性PEDV感染可能反映出经产母猪群缺乏的免疫，而不是存在一种特定的可再感染母猪的环境稳定病毒。所有PEDV分离株理化特性相似，对消毒剂、脱水剂等有相同易感性。因此，农场之间的差异与农场特定的活动和返饲方法相关，而不是由于新病毒株的出现。PEDV稳定场典型特点是较小，比大猪场更可能彻底净化。此外，对感染性PEDV病毒在粪浆（http://www.pork.org/wpcontent/uploads/2014/05/goyal-13-215-main.pdf）和储粪池（Tun et al.,2016）中长期检测的试验数据表明其可能作为再感染的潜在贮存库，在大农场和小农场对粪便的处理方式的不同决定了PEDV稳定群和活跃群之间的差异。“全进全出”的管理实践活动中，由于连续的母猪分娩，新生仔猪持续出生也一定程度影响PEDV在猪群中的传播和持续性。猪群还易通过污染的饲料感染。有研究报告和试验表明在许多无感染农场可能是通过污染饲料发生了PEDV感染（Bowman et al.,2015;Deet et al.,2014;Dee et al.,2016;Kochhar,2014），也有关于PEDV流行起源于中国的假设报道（Huang et al.,2013）。

5 在血清阳性猪群中通过首次/加强母源免疫的策略来增强仔猪保护（针对于地方流行的TGEV和PEDV）

肠道病毒疫苗研究包括TGEV和轮状病毒，儿童脊髓灰质炎病毒（Jafari et al.,2014;John et al., 2014）中，提出自然感染或口服免疫的方式进行首次免疫，而后选用非口途径的亚单位或灭活疫苗进行加强免疫，能够增强或保持黏膜或乳汁免疫效果。经口首免/非口途径加强免疫的策略可解释为何这些非口服疫苗在TGEV或轮状病毒感染或使用口服弱毒疫苗的母猪中是有效的（Saif,1999;Saif et al., 2012）。例如，非口途径免疫TGEV S蛋白亚单位疫苗（包含病毒中和表位），单独接种血清阴性的怀孕母猪无法诱导乳汁IgA抗体的产生和对仔猪的被动保护（Shoup et al.,1997）。然而，当作为口服首免母猪的加强免疫用疫苗时，S蛋白单位疫苗或灭活的TGEV疫苗增强了乳汁sIgA抗体滴度和被动保护效果（Park et al.,1998）。单独使用灭活轮状病毒颗粒疫苗不能诱导肠道sIgA抗体和对仔猪的有效保护，而在使用活疫苗首免后的加强免疫后，产生比口服弱毒轮状病毒活疫苗加强的免疫效果（Azevedo et al.,2013）。乳汁免疫和仔猪免疫保护均可通过使用口服首免活疫苗、非口途径灭活疫苗加强免疫的方式来增强。肠黏膜病毒复制刺激影响经由“肠-乳腺-sIgA轴”的乳汁免疫。这种模式系统也适用于PEDV，也需要类似的母源免疫策略“肠-乳腺-sIgA轴”启动和仔猪保护效果。近期研究人员分别给无PEDV感染的怀孕母猪和感染过PEDV的怀孕母猪在产前5周和2周进行肌注灭活疫苗，进而比较两种母猪的免疫效果。阴性对照母猪使用RT-PCR检测为阴性，无血清学数据。使用1日龄PEDV感染仔猪的粪便，稀释至PCR Ct19，对所有5日龄仔猪进行口服攻击。研究表明，相比无感染母猪，先前接触过PEDV的母猪血清和乳汁中PEDV IgA抗体水平明显增加，在两组母猪中使用灭活疫苗接种均未产生增强的免疫效果；灭活疫苗刺激产生的血清IgG抗体滴度明显增加，无论是无感染母猪还是感染过病毒母猪其血清或乳汁IgA抗体滴度没有明显增加。仔猪死亡率与初乳和乳汁中PEDV IgA抗体滴度相关，先前接触过病毒的母猪，在初乳和乳汁中检测到IgA抗体，其猪窝中仔猪没有发生死亡；而来自于无感染猪群母猪所产仔猪表现高的死亡率。这也提议在管理试验时间和条件下，无论是无感染母猪还是感染过病原母猪，灭活疫苗作为初次免疫或加强免疫对于诱导乳汁免疫无效（Schwartz et al.,Proceedingsofthe2016AASVAnnualMeeting,page363-366）。

6 PEDV疫苗：过去和现在

在20世纪80至90年代的欧洲，由于PEDV暴发明显减少，对于PEDV疫苗的研究主要集中在PEDV强毒株暴发引起巨大经济影响的亚洲国家。1999年以后，中国主要使用PEDV和TGEV二联灭活疫苗（Ma et al.,1995）。2003—2006年，猪群使用PEDV弱毒疫苗。这些疫苗中，尤其是TGEV/PEDV二联灭活疫苗被广泛用来控制PEDV感染。随着2010年出现了毒力更强的PEDV毒株，也迫切需要更有效的疫苗来控制新疫病的暴发。在2010年暴发PEDV期间，疫苗诱导仔猪免疫保护的缺乏可能是高毒力新毒株与经典PEDV毒株的基因遗传分析差异所致，经典毒株和高毒力的新毒株之间诱导交叉中和抗体（Lin et al.,2015;Song et al.,2015）。为获得更有效的疫苗，2014年12月TGEV、PEDV、RoV三联活疫苗获批上市（Song et al.,2015）。据报道在试验猪场该产品表现出增强的保护率，但是关于效力和免疫机制相关的研究资料未公开。韩国从2004年开始使用PEDV弱毒疫苗进行口服免疫，PEDV DR13株在Vero细胞上连续传代至100代，整个致弱过程中通过限制性片段长度多态性分析（RFLP）确定了毒株中9个核苷酸的改变和ORF3基因序列的变异（Song and Park,2012）。在日本，1997年之后，一直使用细胞培养适应的商品化弱毒疫苗（P-5V）。这些疫苗是有效的，但是并不是所有免疫母猪均获得了稳固的乳汁免疫（Song et al.,2015）。一些关于影响乳汁免疫效果低的因素包括疫苗中使用的优势抗原、抗原稳定性、抗原剂量、免疫途径，以及先前讨论的一些其它参数。自2013年PEDV暴发以来，美国批准了两个PEDV疫苗产品，第一个疫苗由Harrisvaccines开发，其基于α病毒表达载体技术（Vander Veen et al., 2012）。2013年第一代疫苗（iPED）在限制使用条件下获准上市，2014年1月第二代疫苗（iPED+）获准上市。iPED+疫苗较iPED疫苗而言，结合了更长S基因片段，该产品标注给经产母猪或后备母猪分娩前肌注1头份。第二个疫苗Zoetis公司开发了灭活疫苗（Florham Park,New Jersey,Study Report No.B826RUS-13-258,Zoetis Inc.），该产品给经产母猪或后备母猪分娩前肌注2头份。虽然这两个疫苗在美国使用，但也缺乏田间效力和免疫相关的公开数据。需要在试验场和现地猪场进行更多研究来确定这些疫苗的效果，以鉴定哺乳仔猪免疫保护关系。

7 结论

充足的乳汁免疫对于哺乳仔猪被动获得对PEDV感染的保护是必需的。虽从TGEV的母源预防效果中获得许多了解，猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的出现诱导了针对TGEV的交叉保护，使得没有更进一步对“肠-乳腺-sIgA轴”和乳汁免疫机制相关变量进行详细研究。目前研究表明，初乳和乳汁IgA和PEDV中和抗体滴度可能与PEDV保护性免疫相关。研究表明，在乳汁分泌物中，充足的IgA和PEDV中和抗体滴度可能依赖于母猪肠道中病毒的剂量和病毒复制区域。关于“肠-乳腺-sIgA轴”诱导和维持的机制仍有很多未知之处。在现地猪场，很多因素导致了疫苗免疫失败，尤其是经过返饲操作。现地观察结果和在亚洲国家的疫苗免疫接种试验中观察到缺乏的乳汁免疫问题，进一步突出我们对影响乳汁免疫诱导因素了解的欠缺，这些因素包括接种剂量，毒株免疫原性，疫苗病毒抗原，经产母猪/后备母猪日龄和疫苗接种时妊娠阶段动物性成熟程度等。我们开发疫苗的策略必须是靶向应答最强的怀孕或泌乳母猪，鉴定影响乳汁免疫的因素有利于改善妊娠猪群PEDV疫苗和其它肠道病原疫苗的免疫计划，有利于改善整个猪群的免疫力和猪场生产效力。

（编辑：郭玉翠）

S828

A

1002-1957(2017)01-0033-08

2016-12-02收稿，2016-12-20修回

吕茂杰（1982-），男，山西静乐人，博士，主要从事兽用疫苗的研究和开发工作.E-mail：lvmaojie650@sina.com

校者简介：杨保收（1962-），男，教授，博士，研究方向为兽医生物技术与疫苗开发.E-mail：bsyang@ringpu.com