光强和光照时间对大肠杆菌光动力灭菌效果的影响

严金华,杨 晨,李泽林,施俊宇,许周速

(浙江工业大学 理学院，浙江 杭州 310023)

光强和光照时间对大肠杆菌光动力灭菌效果的影响

严金华,杨 晨,李泽林,施俊宇,许周速

(浙江工业大学 理学院，浙江 杭州 310023)

为获得光动力灭菌最佳效果，改变光强和光照时间两个光剂量参数，通过对比实验获得最佳灭菌效果时的光剂量.以质量浓度为0.1 mg/mL甲苯胺蓝为光敏剂，灭菌光源为中心波长为660 nm、功率为200 mW的激光二极管，大肠杆菌为试验菌种，通过细菌平板菌落计数法对比获得灭菌效果.实验发现对大肠杆菌具有灭菌效果，且灭菌效果受光强和光照时间两个光剂量参数的影响，随光强的增强和光照时间的延长，灭菌效果呈现先提高后略有下降，得到光动力灭菌效果存在最佳照射时间和光强的结论.

光动力灭菌；甲苯胺蓝；大肠杆菌

光学技术应用于生物、医药等学科是一个新兴的交叉研究领域，比如改善光催化特性[1]与用于环境测量的光纤折射率传感[2].光动力灭菌(Photodynamic disinfection)的基本原理是：选择对细胞具有选择性的光敏剂(Photosensitizer, PS)，使其在目标细菌周围或内部聚集，在合适光源照射下引发光化学反应，光敏剂从基态经寿命极短的单线态带间穿越到三线态这一高能态，处于高能态的光敏剂能级跃迁产生自由基或者单线态氧1O2，上述过程产生的单线态氧或自由基可以与细胞或微生物的磷脂、核酸和蛋白质等生物大分子反应，破坏生物膜结构或其他功能单位，使细胞或微生物死亡[3-4].

采用光动力灭菌方法治疗疾病的方法称为光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)或者光动力抗菌药物疗法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT).光动力灭菌技术最早起源于“一战”前，“一战”中采用该方法挽救了许多生命.但随着“抗生素时代”的到来，光动力灭菌技术没有得到重视，直到近年来“超级细菌”出现及病菌耐药性问题凸显，研究一种有效的且不易产生耐受性的方法十分有必要，因此有关光动力灭菌法的研究再次被广泛开展.国内唐姝姝等[3]研究亚甲基蓝对大肠杆菌的杀伤作用，得出的结论为亚甲基蓝对革兰氏阴性肠出血性大肠杆菌有非常明显的光灭活效果.此外，研究发现二氧化硅纳米粒对大肠杆菌也具有较好的杀菌作用[4].

1 实验目的及准备

光动力技术是一种药械联用的技术，涉及到给药和光照两个过程，影响光动力灭菌效果取决于两个方面：一是光敏剂药物的有效性，包括药物靶向性、在一定的光剂量激发下自由基或者单线态氧的产生效率；二是激发光敏剂的光源及光源参数.国内外针对影响灭菌效果的原因开展了研究，如有研究者提出细菌细胞壁对光敏剂吸收而对灭菌效果的影响[5-6]，革兰氏阴性菌具有复杂的细胞壁结构，屏蔽了单重态氧和细胞膜的有效结合，从而降低了灭菌作用.由于光动力灭菌技术多数研究人员的学科背景为医学或药物研究人员，因此目前绝大多数关于光动力灭菌的研究主要是针对光敏剂的研发及与生物体相关实验，较少涉及光源的使用问题.

在光剂量的问题上，目前国内外的研究者大多采用经验剂量[7-8]，人们直观的感觉，光强越强或者光照时间越长，对灭菌效果的提升应当是有效的，然而，事实并非如此.从光学角度出发，利用实验方法，以获得最优灭菌效果时所需要的光强和光照时间，从而获得光动力灭菌最佳效果时所需要的光强和光照时间两个光剂量参数.为此，进行3组对比实验，分别是加入光敏剂情况下的光照和不用光照、相同光强情况下的不同光照时间和相同光照时间情况下的不同光照强度，以获得光动力灭菌最佳效果时所需要的光强和光照时间两个光剂量参数.

2 实验材料

甲苯胺蓝是一种能有效对抗多钟微生物的光敏剂，其作为光敏剂的光动力疗法在杀灭病原微生物方面有很多优势，它能立刻与微生物结合，几分钟之内就可以进行光照灭菌，不需要在病灶处保持长时间的高质量浓度[9-10].实验以质量浓度为0.1 mg/mL甲苯胺蓝为光敏剂，灭菌光源为中心波长为660 nm、功率为200 mW的激光二极管，大肠杆菌为试验菌种，通过细菌平板菌落计数法对比获得灭菌率.实验所用材料如下：

1) 实验菌种采用大肠杆菌菌株(浙江工业大学生环学院提供)，主要基于以下两点考虑：一是大肠杆菌代谢类型是异养兼性厌氧型，即在有氧和无氧环境均能活动，对细菌培养要求较低；二是大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，对这类菌种研究单位较多，比较容易获取菌株.

将活化的大肠杆菌接种到液体培养基中，37 ℃培养至对数生长期，将细菌悬浊液取出，用分光光度计测出OD600=0.05(108CFU/mL左右)，此时细菌形状稳定，且具有活力.

2) 光敏剂采用甲苯胺蓝(Toluidine blue O，TBO)(上海晶纯生化科技股份有限公司)，粉末平均相对分子质量为305.82，用去离子水将其配置成高质量浓度母液，并按比例稀释成不同质量浓度，避光保存，备用.经分光光度计(岛津UV2550)测量，其峰值吸收波长为663 nm.

3) 光源采用光源为中心波长为660 nm、最大出光功率为200 mW的激光二极管(Laser diode, LD)，光源波长选择主要考虑光敏剂的吸收波谱与光源的波长相匹配的问题，实验选用660 nm正好处于TBO的强吸收峰范围内.

4) 采用激光二极管控制器(ILX LightWave LDC-3990)控制光功率.利用透镜对出光光束进行聚焦，根据焦距和光束参数，获得光束尺寸最小处的面积，并确保光照时光束尺寸最小处照在细菌溶液内，即光照面积不变，而通过控制光功率达到改变光照强度的实验目的.

5) LB液体培养基和LB计数培养基(购自青岛海博生物技术有限公司).LB液体培养基用于大肠杆菌培养，LB计数培养基用于平板菌落计数.

3 实验结果及分析

为了获得最优灭菌效果时所需要的光强和光照时间，进行3组对比实验，分别是加入光敏剂情况下的光照和不用光照、相同光强情况下的不同光照时间和相同光照时间情况下的不同光照强度，通过实验得到光照强度、光照时间分别与灭菌率的关系，进而获得光动力灭菌最佳效果时所需要的光强和光照时间两个光剂量参数.

3.1 有无光照对灭菌效果的影响

首先进行光灭菌效果影响的实验.将制备好的大肠杆菌悬液各取2 mL分别放入3个试剂瓶中，第1和第2个瓶中分别加入0.1 mg/mL的甲苯胺蓝溶液100 μL，第3个试剂瓶不加入甲苯胺蓝也不进行光照，作为对照组.3个瓶都避光孕育10 min后，取出第1试剂瓶进行光照实验，使细菌溶液处于光束照射下，通过设定驱动器的时间设置使光照时间为60 s，控制LED的电流控制输出光功率，根据光束面积估算，使光强约为200 mW/cm2.

光照实验结束后，用移液器分别从3个瓶中取出0.5 mL细菌量溶液，分别滴入LB琼脂培养皿，并放入37 ℃培养环境中分别进行培养，采用平板菌落计数法统计，得到3个瓶中每毫升中菌落单位数分别为的N1，N2和N，其中N为对照组中的细菌菌落数.细菌灭菌率计算公式为

式中：N为对照组每毫升中菌落单位数；Nx为实验组每毫升中菌落单位数.

无光照和有光照射条件下的对比实验数据如表1所示.

表1 有无光照情况下的灭菌率

由表1看出：加入光敏剂而没有光照的情况下，对大肠杆菌也有灭活作用.这是由于甲苯胺蓝通常用作细胞染料，可以为细胞着色，但作为碱性燃料，其对细胞具有一定的灭活作用，但灭菌效率仅为24%，显著低于经过光照后的76.4%.结果表明：光照会使得光敏剂产生活化，从而提高光敏剂对大肠杆菌的杀灭能力.

3.2 光照时间对灭菌效果的影响

实验过程和步骤与3.1类似，即将制备好的大肠杆菌悬液各取2 mL分别放入5个试剂瓶中，分别加入0.1 mg/mL的甲苯胺蓝溶液100 μL，避光孕育10 min后，将其中4个试剂瓶进行光照实验，设置光照时间分别为0，30，60，90 s，第5个作为对照组.光强对比实验同样采用控制变量法，将光强度固定为50 mW/cm2，改变光照时间的长度.测得的数据如表2所示.

表2 不同光照时间的灭菌率

由表2可知：当光敏剂质量浓度保持不变，并保持光强不变，在光照时间由短变长的过程中，灭菌效率先是呈现增长的趋势，然后在75%～80%之前趋于稳定，当时间持续增长时又会出现明显的下降.说明甲苯胺蓝在光强50 mW/cm2的情况下，对大肠杆菌的杀灭效率峰值出现在光照60 s左右，灭菌效率接近80%.这与人们的常规认识不同，即存在一个最佳照射时间，并非时间越长越好.

该结果出现的非常重要的一个原因是：光照不仅激发光敏剂产生自由并杀灭细菌，同时光照也对细菌液有一定的加温作用，而该光动力灭菌实验是在室温情况下进行，光照而导致的适当升温使得温度更接近于细菌适宜繁衍的温度，反而更有助于细菌生长，故存在最佳照射时间.

3.3 光强对灭菌效果的影响

将制备好的大肠杆菌悬液各取2 mL分别放入5个试剂瓶中，分别加入0.1 mg/mL的甲苯胺蓝溶液100 μL，避光孕育10 min后，将其中4个试剂瓶进行光照实验，设置光照强度分别为10，18，50，200 mW/cm2，第5个作为对照组.光强对比实验采用控制变量法，将光照时间固定为60 s，改变激光器功率以改变光强，测得的数据如表3所示.

表3 不同光强的灭菌率

由表3可知：光照时间一定时，随着光强度的增加，灭菌先是呈现上升趋势，当光强到达一定强度后，继续增大光强度，灭菌效率不会出现大的变化，说明当光强达到一定强度以后，光强不再与灭菌效率呈正相关趋势.也就是说，存在一个临界光强度值，当光强超过该临界值，对提高灭菌效率并没有大的提升，说明通过增大光照强度以提高灭菌率是没有意义的，该结果对于将光动力治疗法应用于临床具有重要意义，不仅对于光治疗仪的光源选择更加宽泛，即无需选用功率超大型的光源，降低了对散热的要求，而且对降低患者治疗时的不舒适度也大有益处，因为大功率光源在靠近人体时所带来的热量会让人感觉不适.

4 结 论

以甲苯胺蓝为光敏剂、红光激光二极管为灭菌光源、大肠杆菌为试验菌种，采用细菌平板菌落计数法获得各种情况下的灭菌率，实验发现，利用方法可以实现光动力灭菌，且灭菌率随光照时间呈现先提高后下降的趋势，同时随光强的增强呈现先提高后略有下降的趋势，表明灭菌率并非随着光剂量的提高而单调提高.分析原因，光照产生的热可能是一个重要因素，光照的增强和光照时间的加长给而产生额外的热量，加快了细菌繁殖速度，在一定程度上抵消了灭菌进程.

本文得到浙江工业大学优秀课程建设项目(YX1318)的资助.

[1] 何志桥,韩晶,宋爽.Ag修饰TiO2催化剂紫外光催化还原CO2的研究[J].浙江工业大学学报,2014,42(1):20-26.

[2] 周寒青,隋成华.环境折射率变化对纳米线光纤场强分布的影响[J].浙江工业大学学报,2011,39(2):228-230.

[3] 唐姝姝,唐书泽,李红爱,等.亚甲基蓝对大肠杆菌O157的光动力杀伤作用及机理[J].食品与发酵工业,2012(7):68-72.

[4] 郭辉,孙琼,钱俊青.二氧化硅纳米粒杀菌性能试验[J].浙江工业大学学报,2013,41(6):610-613.

[5] 王钰铖,顾瑛,黄乃艳.光动力灭菌研究进展[J].中国激光医学杂志,2012(2):122-129.

[6] 彭莹莹,葛海燕.光动力抗菌化学疗法治疗难治性细菌感染性疾病的研究进展[J].中国激光医学杂志,2010(1):50-53.

[7] MINNOCK A, VERNON D I, SCHOFIELD J, et al. Mechanism of uptake of a cationic water-soluble pyridinium zinc phthalocyanine across the outer membrane ofEscherichiacoli[J]. Antimicrobial agents & chemotherapy,2000,44(3):522-527.

[8] LACEY J A, PHILLIPS D. The photosensitisation ofEscherichiacoliusing disulphonated aluminium phthalocyanine[J]. Journal of photochemistry & photobiology a chemistry,2001,142(s 2/3):145-150.

[9] 李黎波,李文敏,项蕾红,等.光动力疗法在中国的应用与临床研究[J].中国激光医学杂志,2012(5):278-307.

[10] 栾秀玲,秦艳利,白雪峰,等.甲苯胺蓝为光敏剂的光动力疗法对龈上菌斑灭菌效果的研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2012,28(3):233-236.

(责任编辑：刘 岩)

The efficiency ofEscherichiacoliphotodynamic disinfection effected by light intensity and illumination time

YAN Jinhua, YANG Chen, LI Zelin, SHI Junyu, XU Zhousu

(College of Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310023, China)

In order to obtain the optimal efficiency of photodynamic disinfection, a series of comparative experiments were carried out by changing two parameters including light intensity and illumination time. In the experiments, toluidine blue with concentration of 0.1 mg/mL acts as the photosensitizer, the optical source for sterilization is Laser diode with 650 nm central wavelength and 200 mW power and Escherichia coli is used as test strains. A plate counting method is adopted to evaluate the Disinfection efficiency. Experiments show that photodynamic disinfection efficiency is effected by two optical parameter, i.e. light intensity and illumination time. With the strengthening of optical light intensity and prolonging of illumination time, the disinfection efficiency is firstly increasing and then slightly decreasing. It is concluded that the optimal disinfection efficiency could be obtained by adopting appropriate light intensity and time.

photodynamic disinfection; toluidine blue;Escherichiacoli

2016-03-30

浙江省公益技术研究项目(2015C31094)

严金华(1979—)，男，江苏南通人，副教授，研究方向为光电子器件与光学传感，E-mail：jinhua@zjut.edu.cn.

O439

A

1006-4303(2017)01-0060-04