黄蜀葵提取物对大鼠背部深Ⅱ度烫伤的治疗作用

宋必卫，刘洁琼，章方珺，杨轶安，付再林

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

黄蜀葵提取物对大鼠背部深Ⅱ度烫伤的治疗作用

宋必卫，刘洁琼，章方珺，杨轶安，付再林

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

为观察黄蜀葵提取物(HSK)促进SD大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合作用，利用超级控温烫伤仪制备大鼠深Ⅱ度烫伤模型，以美宝湿润烧伤膏(MEBO)为阳性药，观察烫伤皮肤创面外涂HSK后开始结痂和脱痂时间、愈合时间、创面愈合率和瘢痕形成情况，并取烫伤部位全层皮肤做HE染色切片观察组织损伤和修复状况.结果显示：与模型组相比，HSK给药组大鼠烫伤创面开始结痂、脱痂及完全愈合的时间均明显缩短，各时间点创面愈合率显著提高，烫伤创面愈后瘢痕面积显著减小，烫伤皮肤病理形态显著改善.结果表明：HSK能显著促进烫伤创面的愈合，是一种良好的外用烫伤治疗药物.

黄蜀葵；MEBO；烫伤；创面愈合；瘢痕

烧烫伤一般是指由物化因素如沸水(油)、蒸汽、电、火焰、放射线或化学物质等作用于人体引起的外伤性疾病，是临床上最常见的意外性伤害之一[1-3].我国每年约有2 000万人遭受不同程度的烧烫伤，在因意外伤害而死亡的人数中，烧烫伤仅次于交通事故，排第二位[4-5].烧烫伤常用局部外用药治疗，西药主要用磺胺嘧啶银预防创面感染，毒副作用较多；中药多用湿润烧伤膏(MEBO)治疗.

黄蜀葵是锦葵科秋葵属植物，是传统民间用药，历史悠久，始载于宋代刘禹锡所著的《嘉佑本草》.现代药理研究证明黄蜀葵花主要含黄酮类、有机酸类、甾类及挥发性成分等，具有镇痛、抗氧化、保护心脑血管、治疗慢性支气管炎等功能[6-7].尽管中国药典已明确其功能主治为“外治痈疽肿毒、水火烫伤”[8]，但其治疗烧烫伤作用一直未见药理学研究报道.因此，本研究通过采用超级控温烫伤仪建立大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型，观察HSK提取物对实验性烫伤的治疗作用.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

黄蜀葵干燥花(购自安徽)；美宝湿润烧伤膏(产品批号1506903A，汕头市美宝制药有限公司).

试剂采用95%工业酒精；乙醚、硫化钠(均为分析纯，杭州化学试剂有限公司)；甲醛溶液(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司).

1.2 实验仪器

真空旋转蒸发仪(型号RE-S2A，上海亚龙生化仪器厂)；超级控温烫伤仪(型号YLS-5Q，济南益延科技发展有限公司)；电子分析天平(Mettler Toledo，型号AL104)；倒置光学显微镜(Nikon Eclipse，型号TS100-F DH1).

1.3 实验动物

清洁级SD大鼠，体重220～250 g，雌雄各半，购自浙江省医学科学院实验动物中心，动物许可证号：scxk(浙)20140001.

1.4 黄蜀葵花提取物(HSK)的制备

采用乙醇回流法制备HSK[9-10]，取已粉碎过筛的黄蜀葵花粗粉50.0 g，加入500 mL 80%乙醇，加热回流重复提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇得HSK，计算得率为：得率=(浸膏重量/原料重量)×100%.

1.5 大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型制备

标准饲料喂养，自由饮水，保持饲养环境相对湿度40%～70%，恒温(22±2) ℃，适应性喂养7 d后开始实验.烫伤前24 h，用8%硫化钠溶液小心脱去大鼠背部被毛.次日，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠后，于超级控温烫伤仪上固定，背部朝上，控制压力0.5 kg、温度80 ℃，烫伤时间20 s，即可造成大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型，每鼠4个烫伤创面.

1.6 分组与给药

SD大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、阳性药对照组和HSK实验组，每组8只，雌雄各半.正常组脱毛但不烫伤，其余组用1.5方法制作大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型.除模型组外，其余两组造模后1 h开始外用给药，对照组外涂MEBO(20 mg/cm2)，实验组外涂HSK(10 mg/cm2).参照MEBO使用方法，第1周外涂药物，每天4次，每4～6 h换药1次，每次换药前用温开水清洗创面，洗去残留药物，暴露创面，使药物均匀覆盖创面；第2周，每天3次，每6～8 h换药1次；第3周，每天早晚各给药1次，3周之后直到愈合，每天给药1次.

1.7 创面愈合情况及相关评价指标的测定

1.7.1 创面结痂及脱痂时间的测定

肉眼观察烫伤创面开始结痂、开始脱痂所需的时间.具体判断方法为：烫伤皮肤的边缘开始干燥，形成鳞状皮屑，即为开始结痂的时间；皮肤烫伤部位痂块明显隆起，痂皮边缘开始上翘，与皮肤脱离，即为开始脱痂时间[11].

1.7.2 创面愈合率的测定

给药后每3 d拍摄烫伤创面，记录创面愈合情况.并于造模后1 h和7，14，21 d四个时间点，用透明硫酸纸描绘创面图形，称取创面面积图纸的重量，以该重量的变化间接表示烫伤皮肤愈合面积的变化，并以烫伤后1 h的创面面积作为烫伤面积，分别计算创面愈合率[11-12].创面愈合率计算公式为

1.7.3 创面愈合时间的测定

肉眼观察，以烫伤创面痂皮完全脱落，创面被新生上皮覆盖的时间为创面愈合时间[11]，观察记录每组实验动物创面完全愈合的时间，比较HSK对烫伤创面愈合的影响.

1.7.4 愈后瘢痕面积的测定

待烫伤创面完全愈合后，观察瘢痕形成情况，并用透明硫酸纸覆盖于瘢痕，描绘瘢痕图形，记录下瘢痕面积图纸的重量，计算出瘢痕面积，作为愈后瘢痕面积.

1.8 病理组织学观察

分别于烫伤给药后第7，14，21，28 d处死大鼠，取烫伤部位全层皮肤，10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，于光镜下观察.

1.9 统计处理

采用GraphPad Prism 5软件处理实验数据，用Mean±SD表示；采用One-way ANOVA检验样本均数差异显著性，以p<0.05为差异有显著性意义.

2 结 果

2.1 HSK制备

减压回收乙醇后得到棕褐色HSK浸膏6.65 g，浸膏得率13.3%，其质量分数含生药7.52 g/g浸膏.

2.2 创面开始结痂和脱痂及愈合时间的比较

与模型组(Model)相比较，阳性对照组(MEBO组)完全愈合时间明显缩短(缩短7.8%，p<0.01)，结痂时间和脱痂时间均有缩短趋势；HSK组完全愈合时间缩短13.5%(p<0.001；是MEBO组的1.73倍)，脱痂时间亦显著缩短(p<0.05)，结痂时间缩短趋势明显.上述结果(表1)表明：HSK能显著促进烫伤创面愈合，作用效果比MEBO更佳.

表1 HSK缩短大鼠烫伤创面愈合时间(Mean±SD，n=8)1)

Table 1 HSK shortened the wound healing time in rats (Mean±SD,n=8)

组别剂量/(mg·cm-2)结痂时间/d脱痂时间/d愈合时间/dModel4．70±1．259．62±1．5128．54±1．13MEBO203．90±0．888．15±1．8626．31±1．32∗∗HSK103．60±1．177．66±1．85∗24．69±2．11∗∗∗

注：1) 与模型组(Model)相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

2.3 创面愈合率的测定

深Ⅱ度烫伤累及真皮深层，仅残留深部的少量皮肤附件，需借助创面周围的正常细胞增殖向中心移行覆盖创口；底部的成纤维细胞增殖填补创口以及底部的表皮干细胞增殖、分化形成新表皮以完成修复.从图1动态进程照片中可直观看出：用药后6d，HSK组大鼠烫伤创面痂皮开始脱落，至用药后24d，创面基本愈合，且毛发生长旺盛.与HSK组相比，MEBO组9d时开始出现痂皮脱落现象，24d时创面未完全愈合，表明HSK能明显促进创面愈合且优于MEBO.

分时(7，14，21d)创面愈合率见表2(Mean±SD，n=8)，与模型组相比，HSK组的促愈合效果最为显著，在21d时的创面愈合率已达94%以上，比模型组提高了15.36%，是MEBO组的1.49倍，证明HSK能够明显提高大鼠烫伤创面的愈合速率，是促进烫伤修复的有效药物.

A—模型组；B—MEBO组；C—HSK组图1 大鼠创面愈合进程Fig.1 The process of the scald wound healing

组别剂量/(mg·cm-2)愈合率/%7d14d21dModel10．04±5．8160．24±5．6581．75±2．79MEBO2011．98±5．9481．46±2．21∗∗∗90．18±4．83∗∗HSK1014．08±6．8483．33±2．65∗∗∗94．31±3．82∗∗∗

注：1) 与模型组(Model)相比，**p<0.01，***p<0.001.

2.4 愈后瘢痕面积测定

大鼠烫伤创面愈后瘢痕面积见表3(Mean±SD，n=8)，MEBO组和HSK组的瘢痕面积均明显小于模型组，具有显著性差异(p<0.001)，且HSK亦有优于MEBO的趋势，表明HSK可以在促进愈合同时极为显著抑制体表瘢痕的形成，具有上佳皮肤美容价值.

表3 HSK减小大鼠烫伤创面愈后瘢痕面积1)

注：1) 与模型组(Model)比较，***p<0.001.

2.5 烫伤创面愈合过程病理学变化

分别于给药后7，14，21，28 d取材，HE染色镜下连续观察各组病理组织学变化(图2).正常组皮肤全层完好，角质层、表皮及真皮结构清晰，毛囊及皮肤附属结构完整.模型组在烫伤7 d后，表皮结构破坏，组织水肿并有较多坏死，结构模糊，存在大量炎性细胞浸润；14 d时，表皮仍有坏死组织且崩解；21 d时，创面由肉芽组织覆盖，肉芽组织层薄，上皮爬行速度慢，可见少量纤维细胞排列紊乱；用药后28 d，创面尚未完全上皮化，愈合部分皮下未见毛囊形成，形成瘢痕.HSK组烫伤后7 d镜下可见少量炎性细胞，肉芽组织大量生长；14 d时，表层痂皮脱落，创面被一层较厚的肉芽组织所覆盖，肉芽组织生长明显，成纤维细胞大量增生；21 d，创面基本被上皮组织所覆盖，镜下可见大量纤维细胞；至用药后28 d，表皮已全部覆盖创面，表皮层生长较好，皮下可见少量新生毛囊，纤维细胞排列规则.与HSK组相比，MEBO组14 d时部分创面仍有坏死组织崩解；至28 d未见新生毛囊.综合来看，以HSK修复最快最好.

A—正常组；B—模型组；C—MEBO组；D—HSK组图2 大鼠创面病理学变化Fig.2 The dermatic pathological changes of scald skin in rats

3 结 论

烫伤是日常生活和工作中发生率最高的皮肤性损伤之一.烫伤创面愈合过程复杂，且愈后可遗留瘢痕或功能障碍[13].烫伤创面开始结痂和脱痂时间、创面愈合率及愈合时间是直接、客观而有效的创面愈合评价指标，而创面愈后瘢痕面积的测定则能更加直观的考察药物对创面愈后疤痕的影响.本研究利用超级控温烫伤仪建立大鼠背部深Ⅱ度烫伤模型，考察外涂HSK对烫伤创面愈合的疗效，证明HSK能显著减少创面结痂和脱痂时间，缩短创面愈合时间，提高创面愈合率，且能明显减小瘢痕面积，效果上佳.研究发现所有测定指标上，HSK均有优于MEBO的倾向，限于动物实验样本量小，未达到有统计学意义的结果，基于统计学知识，相信在较大样本研究中完全能实现有统计学意义的结果.文献报道黄蜀葵花主要有效成分为黄酮类化合物，具有抗氧化损伤、镇痛和抗心脑缺血等作用，对口腔溃疡治疗效果好[14-17].目前，我们虽然缺乏其促创面愈合方面的研究，但有理由推论黄酮类化合物也是HSK促进烫伤创面愈合的有效部分，这部分内容将在今后的研究中进一步阐明.总之，HSK安全无毒(可作蔬菜食用)，在减轻创面疼痛和炎症的同时，显著促进创口愈合修复，是一种理想的标本兼治的创面外用治疗剂，开发潜力大.我们的研究还表明：HSK促进烧烫伤修复的机制是保护和促进成纤维细胞和表皮细胞增殖，基于篇幅，留待后续发表.

[1] CHEN Bi, LIAO Zhenjiang, GUO Zhenrong, et al. Chinese burn surgery[M]. Beijing: Springer.2015:113-169.

[2] 王波,邓强,黄韵蓓,等.烧烫伤动物模型研究进展[J].北方药学,2014,11(9):19.

[3] HERNDON D N. Total burn care[M]. Amsterdam: Elsevier Health Sciences,2007.

[4] 黄志群,韦斯,陆钢,等.中西药制剂治疗烧烫伤概述[J].右江民族医学院学报,2013,35(2):196-197.

[5] 国家卫生和计划生育委员会.2015中国卫生和计划生育统计年鉴[M].北京：中国协和医科大学出版社,2015.

[6] 温锐,谢国勇,李旭森,等.黄蜀葵化学成分与药理活性研究进展[J].中国野生植物资源,2015,34(2):37-44.

[7] TODARWAL A, JAIN P, BARI S. Abelmoschus manihot Linn: ethnobotany, phytochemistry and pharmacology[J]. Asian journal of traditional medicines,2011,6(1):1-7.

[8] 中国药典委员会.中国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社,2015:309.

[9] AN Yating, ZHANG Yi, LI Chunmei, et al. Inhibitory effects of flavonoids from Abelmoschus manihot flowers on triglyceride accumulation in 3T3-L1 adipocytes[J]. Fitoterapia,2011,82(4):595-600.

[10] GUO Jianming, XUE Caifu, DUAN Jinao, et al. Anticonvulsant, antidepressant-like activity of Abelmoschus manihot ethanol extract and its potential active components in vivo[J]. Phytomedicine,2011,18(14):1250-1254.

[11] 杨明,尹西拳,李耿.大黄白糖散对大鼠烫伤皮肤的修复作用研究[J].新中医,2014,46(2):193-196.

[12] UPADHYAY N K, KUMAR R, SIDDIQUI M S, et al. Mechanism of wound-healing activity of Hippophae rhamnoides L. leaf extract in experimental burns[J]. Evidence-based complementary and alternative medicine,2011,2011:1-9.

[13] MARTíN-ESPINOSA N M, PIRIZ-CAMPOS R M. Sequelae in patients with severe burns[J]. Revista de enfermeria (Barcelona, Spain),2014,37(2):27-33.

[14] DING Lanting, LI Sheng, JIANG Qin, et al. Effects of total flavone of Abelmoschus manihot (L.) Medic on hemodynamics and myocardial oxygen consumption in anesthetized dogs[J]. Pharmacology and clinics of chinese materia medica,2013,3:79-82.

[15] ZHOU Lei. Advances in studies on total flavone of Abelmoschus manihot (L.) Medic[J]. Journal of liaoning university of traditional chinese medicine,2012,6:42-44.

[16] 韦筠韵,宋必卫,葛建丹.黄蜀葵花的SFE-CO2(乙醇)提取工艺及镇痛活性研究[J].浙江工业大学学报,2008,36(1):30-34.

[17] PRITARN S I, AMOL A T, SANJAY B B, et al. Analgesic activity of Abelmoschus manih at extracts[J]. International journal of pharmacology,2011,7(6):716-720.

The therapeutic effect of Abelmoschus manihot (L.) medic extract on deep second-degree scald in rats

SONG Biwei, LIU Jieqiong, ZHANG Fangjun, YANG Yian, FU Zailin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

To observe the effect of HSK extracted from the flower of Abelmoschus manihot (L.) medic on wound healing of deep second-degree scald in rats. Deep second-degree scald model was set up with a scald apparatus in SD rats. Moist Exposed Burn Ointment (MEBO) was used as the positive control. After modeling, HSK (10 mg/cm2) or MEBO (20 mg/cm2) were applied to the wound surface everyday until the wound healing completely. The time of incrustation and decrustation, wound healing time, the wound healing rate and the scar formation were recorded. The animals were sacrificed and the skin samples were taken for the histological examination. The results showed that, compared with the control group, HSK groups not only significantly decreased the time of incrustation and decrustation, shortened the wound healing time, increased the wound healing rate at the same time, but also reduced the scar area after burn wound healing. Moreover the HSK also can improve the dermatic pathological changes of scald skin. In conclusion: HSK can promote wound healing and can be a satisfying therapy for scald injuries.

Abelmoschus manihot (L.) medic；MEBO；burn wound；wound healing；scar

(责任编辑：刘 岩)

2016-03-23

宋必卫(1956—)，男，安徽岳西人，教授，研究方向为神经分子药理学，E-mail: bwsong@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2017)01-0047-04