广东地区16336例地中海贫血初筛阳性样本基因型分析

周冰燚++++++赵文忠++++++李铭臻++++++徐珊珊++++++顾恒++++++郑立新++++++叶小磊

[摘要] 目的 了解广东地区育龄人群中α、β地中海贫血（简称“地贫”）基因型的分布情況。 方法 收集广东省各区县育龄夫妇血样，以平均红细胞体积（MCV）≤82 fL和/或平均红细胞血红蛋白含量（MCH）≤27 pg作为阳性指标进行地贫初筛，夫妇双方均为阳性时，进行α及β地贫基因检测。应用聚合酶链式反应（PCR）结合膜杂交法进行地贫基因检测，异常病例经测序确证。 结果 共收集地贫可疑样本16 336例，其中，地贫基因携带者13 068例，基因诊断阳性率为80%。检出α-地贫8627例，其中，标准型6852例（41.94%），静止型1529例（9.36%），Hb H病241例（1.48%）和香港型5例（0.03%）。β-地贫3788例（23.19%），α复合β地贫基因携带者653例（4.00%）。α地贫基因型以--SEA/αα（76.15%）最常见，其次为-α3.7/αα（10.13%）和-α4.2/αα（4.63%）。共发现23种β地贫基因突变型，以β41-42/β（39.59%）最常见，其次为β654/β（25.08%）及β-28/β（16.89%）。 结论 MCV联合MCH作为地贫初筛指标操作简单，便于在基层应用。PCR结合膜杂交法检测地贫基因的灵敏度和特异性较好。对育龄夫妇进行地贫筛查并结合基因检测，将有助于提高出生人口素质。

[关键词] 地中海贫血；α-地中海贫血基因型；β-地中海贫血基因型；膜杂交

[中图分类号] R556.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（b）-0073-05

[Abstract] Objective To investigate the distribution of α-， β-thalassemia in couples of children bearing age in Guangdong Province. Methods The samples of newly married couples from different districts and counties of Guangdong were collected and screened. MCV≤82 fL or/and MCH≤27 pg was taken as positive screening indicator. When the screening results of both spouses were positive， genotyping for α- and β-thalassemia was performed by polymerase chain reaction （PCR） combined with membrane hybridization. Abnormal cases were confirmed by sequencing. Results A total of 16 336 cases of suspected thalassemia were identified， in which 13 068 cases were diagnosed as carriers of thalassemia gene， 80% of preliminary screening positive samples were diagnosed genetically. 8627 patients were detected with α-thalassemia， among which 6852 （41.94%） were standard α-thalassemia， 1529 cases （9.36%） were static α-thalassemia， 241 cases were Hb H disease （1.48%） and 5 cases had belong to Hong Kong thalassemia （0.03%）. 3788 cases （23.19%） were β-thalassemia and 653 cases （4.00%） were carriers of both α- and β-thalassemia gene. In α-thalassemia genotype， the most common genotype was --SEA/αα， followed by -α3.7/αα， -α4.2/αα， and the constituent ratio was 76.15%， 10.13% and 4.63%， respectively. A total of 23 genotypes of β-thalassemia were found in this study， the most common mutation subtype was β41-42/β （39.59%）， followed by β654/β （25.08%） and β-28/β （16.89%）. Conclusion MCV combined with MCH as thalassemia screening positive indicator is convenient in basic level hospitals. Meanwhile， the sensitivity and specificity of thalassemia detection by PCR and membrane hybridization is confirmed. Thalassemia screening combination with genetic testing in couple of childbearing age， will improve the quality of birth population.

[Key words] Thalassemia； α-thalassemia genotype； β-thalassemia genotype； Membrane hybridization method

地中海貧血（Thalassemia），简称“地贫”，又称海洋性贫血，是世界上发病率最高的遗传性溶血性贫血，也是危害最严重的血红蛋白病之一[1]。地贫发病主要集中在热带和亚热带地区，好发于地中海沿岸、北非、东南亚和印度次大陆等地区[2]。而我国以长江以南的广大地域为地贫高发区，其中尤以广西、广东和海南三省（区）为甚[3]。地贫为遗传性疾病，主要为编码人体珠蛋白基因缺失或突变，导致某种珠蛋白链合成障碍，如α珠蛋白肽链或β珠蛋白肽链合成障碍，可分别导致α-地贫和β-地贫[4]，也有少见的δβ和γβ型地贫。地贫基因携带者临床表现多样[5]，可表现正常，也可出现需要反复输血的患者。对于重型患者目前尚无根治办法，因此只能通过对婚前、孕前以及产检人群和新生儿进行血液学筛查、基因诊断等手段加以预防，尤其是对同型地贫的高风险夫妇进行产前诊断，淘汰重型胎儿，是目前国际上公认的预防地贫发生的最佳措施[6]。本研究着重对广东地区育龄人群进行地贫筛查并分析基因型，以进一步明确地贫在广东地区分子流行病学特征，为该病防控策略制订奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2013年1月～2015年2月对参加广东省各县区、街道（镇）婚育学校新婚班的育龄夫妇进行孕前地贫筛查，当夫妇双方筛查结果均为阳性时，收集所有样本。

1.2 方法

地贫筛查：主要由广东省各县区计划生育服务站进行，包括如珠海市计划生育服务中心、东莞市计划生育服务中心、中山市人口和计生服务中心等130家机构。部分县区委托当地医院进行。各检测机构技术规范要求如下：采集2～3 mL EDTA抗凝血后，行血常规测定，以平均红细胞体积（MCV）≤82 fL[7]和/或平均红细胞血红蛋白含量（MCH）≤27 pg[8]作为筛查阳性指标。夫妇双方均为阳性时，转移血样到采集卡上，干燥后3 d内送至广东省计划生育专科医院优生技术中心检测。采用潮州凯普血液基因组DNA提取试剂盒对采集卡样本进行DNA提取，用潮州凯普提供的α-和β-地贫基因检测试剂盒（PCR+膜杂交法）进行基因检测，严格按说明书中步骤操作。

1.3 地贫基因检测结果判读

地贫基因反向斑点杂交膜条设3个α和6个β正常对照点，可检测3种α地贫缺失型基因（SEA、3.7、4.2）、3种突变型基因（CS、QS、WS）及15种常见β地贫突变型基因[-28（A-G）、-29（A-G）、Cap（-AAAC）、Int（T-G）、CD14/15（+G）、CD17（A-T）、βE（G-A）、CD27/28（+C）、CD31（-C）、CD41/42（-TTCT）、CD43（G-T）、CD71/72（+A）、IVS-I-1（G-T，G-A）、IVS-I-5（G-C）、IVS-II-654（C-T）]。每次实验所有正常对照点均应显色，突变纯合子及缺失纯合子除外。

图1为膜条上各杂交位点对应图，出现地贫基因突变、缺失时在相应位置会出现杂交信号。图2～5为不同类型地贫基因携带者的杂交图。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，采用描述性统计方法描述地贫筛查的准确率和各种基因型分布情况。

2 结果

2.1 地贫筛查及基因分型情况

广东地区育龄夫妇经血常规筛查（MCV和MCH）疑似地贫16 336例（8168对），经基因诊断明确13 068例，筛查阳性率为80%（13 068/16 336）。α地贫基因携带者9280例，其中，标准型6852例（41.94%），静止型1529例（9.36%）；β地贫基因者携带4441例，单纯β地贫基因3788例（23.19%）；Hb H病241例（1.48）；α复合β地贫653例（4.00%）；香港型地贫5例（0.03%）。见表1。

2.2 α地贫基因突变类型及其构成比

受检的16 336人中检出α-地贫9280例，包括α复合β地贫基因携带者，大部分为--SEA/αα型（76.15%），其次为-α3.7/αα（10.13%）及-α4.2/αα（4.63%）。见表2。

2.3 β地贫基因突变类型及其构成比

受检16 336人中检出β地贫4441例，包括α复合β地贫基因携带者，共检出23种β地贫基因突变类型，最常见突变类型为β41-42/β（39.59%），其次为β654/β（25.08%）、β-28/β（16.89%）及β17/β（9.01%）。见表3。

2.4 α复合β地贫基因突变类型及其构成比

受检16 336人中检出α复合β地贫基因携带者653例，占4.00%，以--SEA/β41-42（17.15%）最常见，其次为--SEA/β654（13.48%）及-α3.7/β41-42（11.18%）。见表4。

3 讨论

地贫是世界上最常见且发病率最高的单基因遗传病之一，现阶段尚无理想治疗方法，本病重在预防，产前筛查结合基因检测技术是降低重症地贫儿出生的重要手段。广东省为地贫高发省份之一，每年新增重型和中间型地贫患儿约4000例[9]。数据显示，广东省人群地贫基因平均携带率约11%，在部分地区可高达16%～20%[1]，其中α地贫和β地贫基因携带率分别为8.30%～8.85%[4，10]和3.36%～3.73%[10-11]。本研究以MCV≤82 fL和/或MCH≤27 pg联合作为地贫筛查阳性的指标，在进行地贫基因检查的16 336例地贫疑似样本中，基因诊断确诊13 068例，筛查总阳性率为80%，敏感度和特异性较好。也有研究提示，在基层医院中可单纯将MCV作为筛查指标，阳性患者再进行HbA2检测，可减少患者负担，并有较高灵敏度[12]。

α-地贫是第16号染色体短臂末端α珠蛋白基因缺陷所致，有缺失型和非缺失型两种，中国人群以缺失型為主[13]，常见东南亚型缺失（--SEA）、右侧缺失（-α3.7）和左侧缺失（-α4.2）。β-地贫为位于染色体11p15.5上的β-珠蛋白基因发生核苷酸的缺失、插入或置换，目前发现的β地贫基因突变超过200种，中国人β地贫基因突变类型有34种[14]，广东省已检出20多种。本研究采用导流杂交技术和低密度基因芯片技术可同时检测3种α-珠蛋白基因缺失、3种α-珠蛋白基因突变以及15种β-珠蛋白基因突变，突破性解决了α-地贫基因缺失无法和突变检测兼容、无法和β-基因突变同步检测的问题，同时也提高检测特异性和灵敏度。本研究受检者共16 336人，检出α-地贫9280例，阳性率为56.8%，常见的3种类型--SEA/αα型、-α3.7/αα及-α4.2/αα占α地贫阳性对象的90.26%，与国内同类研究结果吻合[15-17]；检出β地贫4441例，阳性率为27.19%，共检出23种β地贫基因突变类型，常见为β41-42/β、β654/β及β-28/β，占β地贫阳性对象的81.56%，与广东省内同类研究结果基本吻合[18-19]；检出α复合β地贫基因携带者653例，筛查阳性率为4.00%，发生频率依次为--SEA/β41-42（17.15%）、--SEA/β654（13.48%）及-α3.7/β41-42（11.18%）。说明αβ复合基因突变在广东地区人群中的发生率较高，此类人群血液筛查的表现多以β地贫为主，α地贫的表现被掩盖[20]，临床易漏诊，故对于疑似β地贫者，应同时进行α地贫和β地贫基因检测，以防漏诊。

本研究涉及检测样本量大，时间跨度长，采样点多达130个，采样具有一定的普遍意义。结果较好的反映出广东地区地贫基因分子流行学现状，对降低本地区地贫发生率有一定的指导意义。

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