苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌体外抑制试验

赵清梅，余永涛

(1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021；2.国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室，宁夏银川 750021；3.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌体外抑制试验

赵清梅1，2，余永涛3

(1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021；2.国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室，宁夏银川 750021；3.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

为了确定苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎致病菌的体外抑菌活性，选取奶牛子宫内膜炎致病菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为供试菌株，采用纸片扩散法、牛津杯法对2种生物碱进行了药敏试验，采用液体倍比稀释法测定了其最小抑菌浓度(MIC)。结果表明，苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫中分离的耐药性大肠埃希菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)均有一定的抑制作用。苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL，氧化苦参碱对耐药性大肠埃希菌和MRSA的MIC分别为25 mg/mL和50 mg/mL。

苦参碱；氧化苦参碱；抑菌活性；奶牛子宫内膜炎

子宫内膜炎是奶牛产后常见病，尤其在高产牛群中发病率较高，是危害奶牛业发展的主要疾病之一。患病后，奶牛情期受胎率降低，配种次数增加，产犊间隔延长，淘汰率升高，给奶牛养殖业带来严重的经济损失。奶牛子宫内膜炎主要由非特异性细菌感染引起，大肠埃希菌、葡萄球菌和链球菌等是导致子宫内膜炎常见的条件性致病菌。目前治疗奶牛子宫内膜炎主要采用子宫冲洗和应用抗菌药物。通过抗菌药物治疗虽能控制感染，消除子宫炎症，但对子宫内膜损伤和奶牛繁殖力的修复作用有限。且大量应用抗菌药物常导致牛奶和胴体药物残留超标及细菌耐药问题。近年来，中药已广泛用于子宫内膜炎的治疗和子宫保健，越来越受到奶牛养殖业的重视[1]。

苦参碱和氧化苦参碱为喹诺里西丁类(quinolizidines)生物碱，是苦参(Sophoraflavescens)、苦豆子(S.alopecuroides)、广豆根(S.subprostrata)等中草药的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、杀虫和调节机体免疫力等多种生理功能[2-4]。有研究表明，苦参碱和氧化苦参碱对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌及马拉色菌等有一定的抑制作用[5-7]，已用于仔猪细菌性下痢、羔羊痢疾、奶牛乳房炎等家畜疾病的治疗[8]。以苦参碱和氧化苦参碱为主要药效成分制备的苦参碱栓，已被广泛应用于人宫颈糜烂、慢性宫颈炎、阴道炎等妇科疾病的治疗[9]。但苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎治疗的研究还未见报道。本研究拟开展苦参碱和氧化苦参碱对奶牛子宫内膜炎主要致病菌的体外抑菌试验，为进一步研究开发用于预防和治疗奶牛子宫内膜炎的中药制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌菌株CEP003、大肠埃希菌菌株CEE005，均从宁夏地区奶牛子宫内膜炎临床病料中分离并鉴定[10]。质控菌株为敏感菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922，均购自中国药品与生物制品检定所。

1.1.2 主要试剂 苦参碱和氧化苦参碱，宁夏紫荆花药业有限公司产品，生产批号：20110419，纯度(HPLC)≥98%；青霉素G、氨苄西林、头孢西丁、头孢唑啉、苯唑西林、氧氟沙星、诺氟沙星、强力霉素、卡那霉素、链霉素药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌CEP003和CEE005菌株对常用抗菌药物的敏感性试验 采用纸片扩散法(K-B法)检测CEP003和CEE005菌株对常用抗菌药物的敏感性。将金黄色葡萄球菌CEP003和大肠埃希菌CEE005菌株在普通琼脂上划线培养。挑取单菌落，接种于MH肉汤，置37℃恒温振荡培养过夜，与麦氏比浊管对比，用无菌生理盐水将菌液稀释为1.5×108CFU/mL。取适量稀释的菌液均匀涂布于MH平板表面，静置5 min后，分别将青霉素G、氨苄西林、头孢西丁、头孢唑啉、氧氟沙星、诺氟沙星、卡那霉素、链霉素等药敏片贴于平板表面。37℃培养24 h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径。以金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922等标准菌株为质控菌，依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的标准[11]，根据抑菌圈直径判定CEP003和CEE005菌株对各种药物的敏感性，将其分为耐药(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。

1.2.2 苦参碱和氧化苦参碱对CEP003和CEE005菌株的体外抑菌试验

1.2.2.1 滤纸片法 采用滤纸片法进行体外抗菌活性预试，用打孔器制备直径为6 mm的滤纸片，高压灭菌烘干后，分别置浓度为5、25、50、100、200、400 mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱药液中，浸泡24 h，取出晾干，使滤纸片上的药物含量分别为2.5、5、10、20、40 mg/片。取适量稀释的金黄色葡萄球菌CEP003、大肠埃希菌CEE005、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922等菌液均匀涂布于MH平板上，静置5 min，将上述制备的含有苦参碱和氧化苦参碱的滤纸片贴于平板表面，37℃培养24 h后观察滤纸片周围有无抑菌圈出现，有抑菌圈出现记为“+”,无抑菌圈出现记为“-”，并测定抑菌圈直径。

1.2.2.2 牛津杯法 分别用玻璃涂布器将金黄色葡萄球菌CEP003、大肠埃希菌CEE005、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922菌株菌悬液涂布于MH平板上，静置5 min。在每个培养皿中放置牛津杯，并轻轻按压。在每个牛津杯中分别加入200 μL的不同浓度的苦参碱和氧化苦参碱药液，其浓度分别为2.5、5、10、20、40 mg/mL，置4 ℃冰箱内预扩散2 h，然后将各培养皿放置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察各培养皿中是否出现抑菌圈，有抑菌圈出现记为“+”，无抑菌圈出现记为“-”，记录抑菌圈的直径。

1.2.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用液体倍比稀释法测定苦参碱和氧化苦参碱对金黄色葡萄球菌CEP003、大肠埃希菌CEE005、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922菌株的MIC[3]。用无菌蒸馏水稀释苦参碱和氧化苦参碱，使其终浓度为800 mg/mL，取无菌试管10支，分别编号为1～10，每管加入MH肉汤培养基1 mL，取1 mL上述浓度药液加入1号试管并混匀，从1号试管吸取1 mL液体加入2号试管并混匀，再从2号试管吸取1 mL液体加入3号试管，依次类推倍比稀释至第8号试管，各管药物浓度依次为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL。各管中依次加入100 μL待测菌液，9号管加菌液不加药液为阴性对照，10号管既不加菌液也不加药液为空白对照，每种药物重复3次。将接种好的试管置恒温摇床37℃，150 r/min，振荡培养24 h，肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度，即为该药物对受试菌的MIC。

2 结果

2.1 常用抗菌药物药敏试验结果

结果见表1。金黄色葡萄球菌CEP003对各种药物均耐药，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。大肠埃希菌CEE005除对头孢类药物中度敏感外，对青霉素G、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星、卡那霉素均耐药。

表1 金黄色葡萄球菌CEP003和大肠埃希菌CEE005对常见抗菌药物的敏感性试验结果

注：“R”表示耐药,“I”表示中度敏感。

Note：“R” means resistance,“I” means medium sensitivity.

2.2 体外抑菌活性试验

苦参碱和氧化苦参碱体外抗菌活性预试结果见表2。在纸片扩散法和牛津杯法中，2种生物碱对大肠埃希菌产生的抑菌圈直径均显著大于金黄色葡萄球菌，苦参碱对2种细菌的抑制作用均显著强于氧化苦参碱。

2.3 最小抑菌浓度测定结果

苦参碱和氧化苦参碱对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌最小抑菌浓度(MIC)测定结果见表3。

3 讨论

奶牛子宫内膜炎是奶牛常发病之一，细菌感染是其主要原因。引起奶牛子宫内膜炎的病原菌种类很多，不同的地域、不同的牛场，甚至同一牛场的不同的个体因饲养环境、产后护理等因素其病原菌不同，尽管已报道的各地病原菌种类不一致，但多数研究者发现其主要致病菌为葡萄球菌、大肠埃希菌和链球菌[1]，从宁夏地区奶牛子宫内膜炎患牛分离出的主要致病菌为大肠埃希菌和葡萄球菌[10]，因此本研究以其为供试菌株。目前，宁夏地区治疗奶牛子宫内膜炎主要采用静脉注射青霉素、氨苄西林等抗菌药物。药敏试验结果表明，CEP003对各种药物均耐药，CEE005菌株除对头孢类药物中度敏感外，对青霉素G、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星及卡那霉素均产生耐药。抗菌药物的大量使用使得耐药菌株不断产生，生产中为了提高疗效，往往会加大药物的使用剂量，不仅增加了生产成本，还会导致生鲜乳药物残留超标，带来严重的食品安全问题。

表2 不同浓度的苦参碱和氧化苦参碱体外抑制作用

注：“-”表示无抑菌效果。

Note:“-”indicated that inhibition zone is not observed.

表3 苦参碱和氧化苦参碱最小抑菌浓度(MIC)测定结果

体外抑菌试验结果表明，苦参碱和氧化苦参碱对分离自奶牛子宫的2种耐药性致病菌和标准菌株均有不同程度的抑制作用，大肠埃希菌对苦参碱和氧化苦参碱的敏感性要显著高于金黄色葡萄球菌，2种菌对苦参碱的敏感性也高于氧化苦参碱。有报道认为，苦参碱被氧化为氧化苦参碱后，分子中氮原子价态发生了变化，苦参碱中的一个胺变成了氧化胺，导致了抑菌活性降低[12]。牛津杯法体外抑菌试验表明，当苦参碱浓度为2.5 mg/mL时，即会对大肠埃希菌菌株CEE005、ATCC25922产生轻微的抑制作用。最小抑菌浓度测定结果也表明，苦参碱和氧化苦参碱对大肠埃希菌的最小抑菌浓度分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL，对金黄色葡萄球菌菌株的最小抑菌浓度为25 mg/mL～50 mg/mL和50 mg/mL。据张爱君等[12-13]报道，苦参碱对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为12.5 mg/mL和25 mg/mL。陈静等[5-6]研究了苦参碱和氧化苦参碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的体外抗菌活性，结果表明苦参碱、氧化苦参碱对MRSA的最小抑菌浓度为31.6 mg/mL和50 mg/mL，对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA) 的最小抑菌浓度为22.5 mg/mL和32.5 mg/mL。本试验中，苦参碱和氧化苦参碱对MRSA和MSSA也均有一定的抑制作用，与陈静等的结果较为接近。

苦参碱具有抗菌、抗炎、抗瘤、抗病毒和调节机体免疫系统等方面作用，被广泛用于临床。本试验选择中草药提取物苦参碱、氧化苦参碱对临床分离的导致奶牛子宫内膜炎的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌进行体外抗菌作用研究，结果显示苦参碱、苦参碱对从临床分离的耐药性菌株和敏感菌株均有一定的抑菌活性。但其最小抑菌浓度远远高于临床上已广泛应用的抗菌药物，下一步需要对2种药物的体内使用剂量和对以上病原感染的治疗效果进行研究。

参开文献:

[1] 邓祥华,张志强,范才良,等.奶牛子宫内膜炎病原菌的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2013(7):28-30.

[2] 张 梅.苦参碱和氧化苦参碱的提取纯化工艺及其抑菌、复盐研究[D].甘肃兰州：兰州理工大学石油化工学院，2012.

[3] 李媛媛，阎 旭，李墨林，等.氧化苦参碱体外抑菌活性的研究[J].中国微生态学杂志，2012， 24(3)：244-250.

[4] Yi Jin,Jianli Hu,Qiong Wang，et al.Effects of qxymatrine on the apoptosis of human esophageal carcinoma Eca109 cell line and its mechanism [J].J Huazhong Univ Sci Technol(Med Sci),2008,28(3):314-316.

[5] 陈 静,哈丽娜,王 秀.苦参碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌作用的实验研究[J].长治医学院学报,2012,26(3):161-163.

[6] 张爱君，赵清国，哈丽娜,等.氧化苦参碱对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌活性的实验研究[J].包头医学院学报,2013,29(3):11-13.

[7] 高承霞,严 祥,韩 俭,等.苦豆子生物碱对幽门螺杆菌耐药株的体外抑菌研究[J].第三军医大学学报,2012,34(11):1126-1127.

[8] 冷晓红，王志强，李 军.苦豆子生物碱对奶牛乳房炎致病菌体外抗菌活性的研究[J].中国兽药杂志，2013,47(9)：31-33.

[9] 周 玲.苦参碱及氧化苦参碱生物活性研究进展[J].农业与技术，2009,29(6)：66-68.

[10] 赵清梅，余永涛，任 贤.宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].动物医学进展，2015，36(8)：114-119.

[11] Nationel Committee for Clinical Laboratory Standards． Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [J]． Ninteenth Informational Supplement，2009，29(3):47-56．

[12] 张爱君,张彩芳,王秀青.三种生物碱体外抑菌活性的测定[J].长治医学院学报，2011,25(5)：335-337.

[13] 张爱君,张彩芳,王秀青,等.苦参碱和氧化苦参碱体外抑菌浓度研究[J].宁夏医科大学学报，2011,33(9)：855-856.

Antibacterial Activity of Matrine and Oxymatrine on Pathogenic Bacteria Causing Cow EndometritisinVitro

ZHAO Qing-mei1,2,YU Yong-tao3

(1.CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeifangUniversityofNationalities,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 2.KeyLaboratoryofFermentation,BrewingEngineeringandBiotechnology,StateNationalitiesAffairsCommission,Yinchuan,Ningxia,750021,China; 3.CollegeofAgronomy,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

To investigate the antibacterial effects of matrine and oxymatrine on the pathogenic bacteria isolated from uterus of cows with endometritis,the experiment was conductedinvitro.The antibacterial effects on drug-resistanctE.coliand methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) were screened by Kirby-Bauer paper dispersion and Oxford cup method respectively.The minimal inhibitory concentration (MIC) of matrine and oxymatrine against drug-resistanctE.coliand MRSA were determined respectively by the method of tube double dilution method.The results showed the drug-resistanctE.coliand MRSA were inhibited by matrine and oxymatrine in different degree.MIC of the matrine against the drug-resistanctE.coliand MRSA were 12.5 mg/mL and 25 mg/mL.MIC of the oxymatrine against the drug-resistanctE.coliand MRSA were 25 mg/mL and 50 mg/mL.

matrine；oxymatrine；antibacterial activity；cow endometritis

2016-09-18

宁夏自然科学基金项目(NZ12202)

赵清梅(1979-)，女，四川南江人，副教授，博士，主要从事临床兽医学研究。

S853.76

A

1007-5038(2017)01-0065-04