巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性评价

潘金春，任柏桦,闵凡贵，陈瑞爱，王希龙*，王林川*，王凤国，罗书明，叶健聪，刘 玲，黄鹏华

(1.广东省实验动物监测所，广东广州 510663；2.广东省实验动物重点实验室，广东广州 510663；3.广东温氏大华农生物科技有限公司，广东新兴 527400; 4.华南农业大学兽医学院， 广东广州 510642)

巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性评价

潘金春1,2△，任柏桦3,4△,闵凡贵1,2，陈瑞爱3,4，王希龙1,2*，王林川3,4*，王凤国3，罗书明3，叶健聪3，刘 玲3，黄鹏华3

(1.广东省实验动物监测所，广东广州 510663；2.广东省实验动物重点实验室，广东广州 510663；3.广东温氏大华农生物科技有限公司，广东新兴 527400; 4.华南农业大学兽医学院， 广东广州 510642)

为评价巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的敏感性，本研究选择PRRSV抗体阴性的16头巴马小型猪和17头本地二元杂交猪作为研究对象，分别分为低剂量接毒组、高剂量接毒组、对照组1和对照组2，低剂量、高剂量接毒组肌肉注射接种PRRSV NVDC-JXA1强毒株，对照组1和接毒组混合饲养，对照组2分开饲养作为空白对照。接毒后每天测量体温，观察精神、食欲、死亡等情况，死亡动物剖检病变，攻毒后每隔7 d采血用RT-PCR法检测病原，连续观察21 d。结果绝大部分猪体温升高到41℃以上，且有3个以上温次，所有接种及混养动物都死亡，巴马小型猪死亡时间在8 d～17 d，二元杂交猪在7 d～13 d，死亡动物出现肺充血、出血、实变，扁桃体、淋巴结、肝脏、肾脏、皮下有出血等症状，病原RT-PCR检测为阳性，说明攻毒动物死于HP-PRRS，表明巴马小型猪对PRRSV NVDC-JXA1强毒株非常敏感，可用于PRRS活疫苗的检验。

巴马小型猪；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；敏感性评价

猪繁殖与呼吸综合征(Procine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是20世纪80年代出现的一种新猪病，1987年美国与加拿大首次报道该病，随后欧洲也报道了类似疾病[1]。2006年5月份以来，我国江西、河南、河北、山东、北京及广东等地猪群出现了高热不退、体表发红、呼吸困难、高发病率及病死率为主要特征的疫情[2]，后经实验室诊断确诊为高致病性PRRS(Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，是由PRRSV变异株(NVDC-JXA1株)引起的[3]。

PRRS给养猪业造成了巨大的损失，但却没有特异的治疗方法，目前疫苗免疫仍是最主要的预防措施[4]。其中，弱毒疫苗的免疫效果要好于灭活疫苗[5]。根据农业部第1548号公告[6]，需要用对HP-PRRSV NVDC-JXA1强毒株易感的猪对PRRS活疫苗进行安全检验和效力检验，目前常用的检验用猪为本地二元杂猪。

与普通家猪相比，小型猪因体型较小而便于操作和饲养管理，成本较低，遗传选择、遗传控制也更符合实验动物的要求[7]。为了选择一种合适的易感小型猪，本研究前期对蓝塘猪、蕨麻小型猪、巴马小型猪、五指山小型猪等几种小型猪种进行了HP-PRRSV初步攻毒试验[8]，结果发现巴马小型猪和五指山小型猪白系对PRRSV NVDC-JXA1株强毒的敏感性较高，可能适合于HP-PRRS活疫苗检验。为了进一步验证及评价巴马小型猪对PRRSV NVDC-JXA1株强毒的敏感性，本研究进一步开展攻毒试验，以验证其敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 巴马小型猪16头，来源于广东省实验动物监测所和广东温氏大华农生物科技有限公司合作建立的小型猪繁育基地，体重7.1 kg～12.5 kg，55日龄～70日龄；二元杂交猪17头，从本地购得，体重8.6 kg～12.2 kg，40日龄左右。各猪种雌雄不限。试验前采血清用ELISA方法检测PRRSV抗体均呈阴性。1.1.2 毒株 HP-PRRSV NVDC-JXA1毒株(JXA1-R株)由中国动物疫病预防控制中心提供，用Marc-145细胞进行培养，测得TCID50为104.5/mL。1.1.3 试剂盒及仪器 PRRSV抗体ELISA检测试剂盒，IDEXX公司产品；PRRSV RT-PCR检测试剂盒，世纪元亨公司产品；PCR仪为Eppendorf产品。

1.2 方法

1.2.1 分组及接种 将试验猪按表1进行分组，共分8组，2种试验猪的分组方法一样，都分成4组，包括低剂量接毒组，接种剂量为高剂量组的1/10；高剂量接毒组，接种剂量为3×104.5TCID50/mL，此剂量为常规疫苗检验中使用的攻毒剂量；对照组1，与攻毒动物混养，检验病毒的传播情况；对照组2，与攻毒猪分开饲养，作为整个试验的空白对照。

1.2.2 观察检测内容 1.2.2.1 一般观察及体温测量 接毒后每天观察试验猪精神、食欲和死亡等情况，死亡动物解剖观察病变。试验周期21 d，存活猪只在21 d处死剖检。1.2.2.2 体温测量 接毒后每天定时(上午8点～10点)测量肛温，并记录每日体温情况。

表1 试验猪分组

1.2.3 PRRSV RT-PCR检测 攻毒后每7 d前腔静脉丛采血5 mL，分离血清，采用PRRSV RT-PCR检测试剂盒检测PRRSV，主要步骤如下：病毒RNA抽提→RT-PCR扩增(42℃ 45 min；95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35次循环；72℃ 7 min)→电泳。结果判定：阳性样品出现436 bp扩增带，阴性样品无带出现。

1.2.4 统计方法 试验猪死亡情况用SPSS16.0软件制作成生存曲线，体温数据输入Excel软件中制作变化曲线。

2 结果

2.1 一般观察

低剂量接毒组、高剂量接毒组、对照组1动物都出现精神沉郁、食欲下降现象，部分猪表现气喘、呼吸困难；对照组2动物在整个试验周期都表现正常。

2.2 死亡情况

接毒后各组动物生存曲线见图1，2种试验猪的低剂量组、高剂量组、对照组1的动物全部死亡，巴马小型猪在攻毒后8 d～17 d死亡，二元杂猪在攻毒后7 d～13 d死亡，对照组2动物在整个试验周期均未死亡(数据不包含在图1中)。

2.3 病理剖检

病死猪剖检可见肺脏充血、出血、实变(图2)，病变主要出现在肺心叶和尖叶。另外，还可见扁桃体肿大、出血，腹股沟淋巴结肿大、充血，皮下、肝脏、肾脏可见出血点或出血斑等病变。

2.4 体温

试验猪体温变化曲线(各组平均值)见图3，低剂量组、高剂量组和对照组1试验猪在攻毒后第1天大部分就出现体温升高(40℃左右)，其中巴马小型猪都在39.5℃以上，二元杂交猪则各组有1头～2头不超过39.5℃；从第2天开始体温有所波动，但大部分试验猪体温都超过39.5℃，并达到41℃以上，且有3个以上温次。在整个试验周期中，对照组2动物都未出现体温升高(小于39.5℃)。

2.5 RT-PCR检测结果

如图4所示，接种后第7天低剂量组、高剂量组和对照组1试验猪样品都出现436 bp的阳性条带，对照组2动物样品检测结果为阴性。接种后14 d存活动物的样品仍可见436 bp的阳性条带，对照组2动物样品检测结果仍为阴性。

图1 攻毒后各组生存曲线

A、B.巴马小型猪肺正反两面图；C、D.二元杂猪肺正反两面图

图3 试验猪接种后体温变化曲线

A.1.阴性对照；2.阳性对照(436 bp条带)；3.DNA标准DL 2 000；4～18.分别为二元杂猪低剂量组(5头)、高剂量组(5头)、对照组1(5头)

B.1.阳性对照(436 bp条带)；2.阴性对照；3.DNA标准DL 2 000；4～17.分别为巴马小型猪低剂量组(5头)、高剂量组(5头)、对照组1(4头)；18、19.二元杂猪对照组2(2头)；20、21.巴马小型猪对照组2(2头)

A.1.Negative control;2.Positive control (436 bp); 3.DNA Marker DL 2 000; 4-18.Lower dose group (5),higher dose group (5),and control group 1 (5) in binary hybrid pigs

B.1.Positive control (436 bp);2.Negative control;.3.DNA Marker DL 2 000;4-17.Lower dose group (5),higher dose group (5),and control group 1 (4) in Bama minipigs;18,19.Control group 2 (2) in binary hybrid pigs;20,21.Control group 2 (2) in Bama minipigs

图4 RT-PCR检测电泳图

Fig.4 The electrophortic patterns of RT-PCR

3 讨论

HP-PRRS具有发病急、传播快、发病率高、病死率高等特点，以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，40日龄以内的仔猪病死率高达100%，育肥猪病死率约为50%；在一些地区的猪场，发病率接近100%，病死率在30%～50%，甚至部分猪场的病死率可达80%以上[9]。HP-PRRS还是一种高度接触性传染病，并可持续性感染，是对养猪业的一个重大威胁，会造成重大经济损失。因此，加强对HP-PRRS的防控非常重要。

根据农业部《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》规定，符合临床病理指标，同时HP-PRRSV分离鉴定阳性或HP-PRRSV反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测阳性，即可确诊为HP-PRRS感染。本研究中，攻毒猪出现精神沉郁、食欲下降，气喘、呼吸困难等症状，死亡猪剖检可见肺脏充血、出血、实变，扁桃体、淋巴结、肝脏、肾脏、皮下有出血，体温升高到41℃以上，符合HP-PRRS临床病理特征；同时，接毒猪血清的PRRSV RT-PCR检测为阳性，说明接毒猪都感染了HP-PRRSV，并发病表现临床症状，直至死亡。

根据农业部第1548号公告规定[6]，HP-PRRS敏感的猪种攻毒后21 d死亡率要达到40%(2/5)以上，本研究中巴马小型猪和二元杂猪死亡率都为100%，能够满足其敏感性要求，可以用于HP-PRRS活疫苗的检验。本研究中高剂量接毒组的接种剂量为3×104.5TCID50/mL，此剂量为常规疫苗检验中使用的攻毒剂量，而低剂量接毒组的接种剂量是高剂量组的1/10，但动物死亡率都为100%，说明巴马小型猪和二元杂猪对HP-PRRSV的敏感性都非常高。本研究中对照组1动物未接种病毒，而与攻毒猪一起混养，但该组动物死亡率也为100%，说明攻毒猪接种后很快就可以排毒，并且容易通过接触传播。

[1] 薛 平，曲向阳.我国高致病性蓝耳病研究进展[J].安徽农业科学，2014，42(5)：1389-1392.

[2] Zhou L,Yang H C.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China [J].Virus Res,2010,154:31-37.

[3] Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark [J].PLoS One,2007,2:526.

[4] 张传红.高致病性猪蓝耳病的防治技术[J].中国畜禽种业，2014(4)：132-133.

[5] 段和荣.不同类型猪蓝耳病疫苗的免疫效果比较[J].中国畜牧兽医文摘，2014,30(2)：102.

[6] 高致病性猪繁殖与呼吸道综合征活疫苗(JXA1-R株)质量标准、说明书和内包装标签[E].中华人民共和国农业部公告第1548号.

[7] 孙 倩.实验动物学基础[M].北京：北京科学技术出版社，2005.

[8] 潘金春，任柏华，闵凡贵，等.不同品系小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性筛选[J]. 中国比较医学杂志，2015，2(6)：14-17.

[9] 李建玲，杨小亮.高致病性猪蓝耳病的研究进展[J].中国兽医杂志，2014，50(6)：61-63.

Susceptibility Evaluation of Highly Pathogenic Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Bama Minipigs

PAN Jin-chun1,2,REN Bo-hua3,4,MIN Fan-gui1,2,CHEN Rui-ai3,4, WANG Xi-long1,2,WANG Lin-chuan3,4,WANG Feng-guo3, LUO Shu-ming3,YE Jian-cong3,LIU Ling3,HUANG Peng-hua3

(1.GuangdongLaboratoryAnimalsMonitoringInstitute,Guangzhou，Guangdong，510663，China; 2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLaboratoryAnimals,Guangzhou,Guangdong，510663，China; 3.GuangdongWensDahuanongBiotechnologyCo.,Ltd.,Xinxing,Guangdong，527400,China; 4.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong，510642,China)

To evaluate the sensibility to highly pathogenic procine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) in Bama minipigs,16 Bama minipigs and 17 local binary hybrid pigs,whose PRRSV antibodies were negative,were divided into lower dose group,higher dose group,control group 1 and control group 2,respectively.Pigs in lower dose group and higher dose group were injected intramuscularly with virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV,pigs in control group 1 were mixed with inoculated groups,and in control group 2 were segregated as blank control.Animals were continuously taken temperatures and observed for 21 days on mental condition,appetite,survival after inoculation.The dead pigs were examined by autopsy.Blood was collected for detecting virus by RT-PCR every 7 days.As a result,body temperatures of most pigs were raised above 41 ℃,and the hyperthermias were recorded more than 3 times.All inoculated and mixed animals were dead,and the dead time was 8 to 17 days in Bama minipigs,as well as 7 to 13 days in binary hybrid pigs.The dead animals showed hemorrhages and consolidations in lungs,and hemorrhages in tonsils,lymph glands,livers,kidneys and subcutaneous tissues.The testing results of RT-PCR were positive.Above all,the inoculated animals died of HP-PRRSV.In conclusion,Bama minipigs were sensitive to virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV,and should be used for the inspection of HP-PRRS live vaccine.

Bama minipig; Highly pathogenic procine reproductive and respiratory syndrome virus; susceptibility evaluation

2015-04-07

广东省科技计划项目(2015A030302028，2015A030303004，2015A030302035)；广东省教育部产学研结合项目(2012B091100466)

潘金春(1979-)，男，江苏宝应人，助理研究员，硕士，主要从事比较医学、实验动物标准化和实验动物质量监测研究。△同等贡献作者 *通讯作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)01-0056-05