大庆市及周边地区非免疫猪群猪圆环病毒感染情况调查

翟宝库，谭海东，张冠群

(大庆市动物疫病预防与控制中心，黑龙江大庆 163311)

大庆市及周边地区非免疫猪群猪圆环病毒感染情况调查

翟宝库，谭海东，张冠群

(大庆市动物疫病预防与控制中心，黑龙江大庆 163311)

为了解大庆市及周边地区猪群中PCV的感染情况，应用ELISA和PCR技术对采自大庆市5区4县及周边地区55个村屯/猪场未免疫PCV2疫苗猪血清样本649份，5家病猪场和6家屠宰场组织样本448套，进行血清学和分子生物学检查，并对检测结果进行了比较分析。结果显示，大庆市及周边地区未免疫PCV2疫苗猪血清样品PCV2抗体平均阳性率为54.70%，其中断奶仔猪样品阳性率为50.68%，育肥猪样品为70.00%，繁育母猪样品为54.70%。组织样品PCV1阳性率为4.46%，PCV2阳性率为22.32%。调查结果可为确定地区流行毒株序列提供原始材料和制定科学防控措施提供依据。

猪圆环病毒； 酶联免疫吸附试验；聚合酶链式反应 ；流行病学；调查

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是无囊膜的单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科、圆环病毒属成员，是迄今发现的最小动物病毒，有2个血清型，猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1，PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)[1-2]。一般认为PCV1是实验室猪源传代细胞污染病毒，在猪群中广泛存在，对猪无致病性，但一些国外学者报道提示PCV1可能具有潜在的致病性或协同致病作用[3]，已引起广泛关注。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病毒，同时也是猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、新生仔猪先天性震颤(Congenital tremors of piglet，CT)及母猪繁殖障碍等疫病相关联的重要病毒[4]。PCV2还能侵害猪的免疫系统，抑制免疫功能，与猪流感、猪支原体肺炎、猪副嗜血杆菌和猪链球菌病等相互作用，加重危害[5]。据李海超等[6]对2005年-2012年发表论文的统计报道，2005年PCV2感染率为52.8%(19/36),至2012年感染率已上升到为71.4%(162/227)，期间虽有波动，但总体呈上升趋势，已严重威胁养猪业发展。

为了解大庆市及周边地区猪群中PCV感染情况，特别是PCV2感染情况，2014年1月至2015年12月，笔者组织采集大庆市5区4县及周边地区村屯或猪场未免疫PCV2疫苗猪血清样本649份，病猪场和屠宰场组织样本448套，进行PCV2抗体和PCV1、PCV2核酸调查，为确定地区流行毒株序列提供原始材料和制定科学防控措施提供基础依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 待检样本

1.1.1.1 血清样本 2014年1月至2015年12月，对大庆市5区4县及周边地区已知未免疫PCV2疫苗的21个村屯，34个猪场(包括部分屠宰场)猪只进行随机采集，根据饲养数量多少每地(村屯、猪场和屠宰场)每次采集5份～40份，共采集血清样本649份，其中断奶仔猪样本440份，育肥猪样本180份，母猪及后备母猪29份。

1.1.1.2 组织样本 采自5个疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征发病猪场病死猪组织样本13套(肝、脾、肺、扁桃体和淋巴结等)，6家屠宰场组织样本435套。

1.1.2 主要试剂 PCV2 ELISA抗体检测试剂盒由武汉科前动物生物制品有限责任公司生产(批号140111)。

1.1.3 引物合成 根据国家标准(GB/T21674-2008)猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法合成2对特异性引物。PCV1引物序列：P1:5-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3，P2：5-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3 ，产物长度为652 bp；PCV2引物序列：P1:5-CCGCGGGCTGGCTGAAC-TT-3，P3：5-ACCCCCGCCACCGCTACC-3，产物长度为1 154 bp，由上海invitrogen生物技术公司合成。引物工作浓度10 pmol/μL。

1.2 方法

1.2.1 样品准备 前腔静脉或耳静脉采集猪全血，37℃温箱放置1 h，4℃静置过夜，已析出血清的直接吸出，置-20℃保存备用；未析出血清的，剥离血凝块，使之与管壁分离，3 000 r/min离心10 min，吸出血清，置-20℃保存备用。组织样本无菌采集后置-20℃保存备用。

1.2.2 血清样本ELISA检测 参照试剂盒说明书应用洗涤液洗涤包被板2次，拍干；血清样品按1∶40稀释，阴、阳对照血清按1∶4稀释；取100 μL稀释好的待检和阴、阳对照血清加入到标记好的包被板对应孔中，待检血清各一孔，阴、阳对照血清各两孔，37℃温育30 min；取出包被板洗涤5次，拍干；每孔加100 μL羊抗猪酶标二抗， 37℃温育30 min；取出包被板洗涤5次，拍干；每孔加50 μL底物A液和50 μL底物B液，混匀，室温避光显色10 min；取出每孔加50 μL终止液，10 min内酶标仪上测量各孔OD 630 nm值；阳对照血清OD值≥0.7，阴对照血清OD值<0.3试验成立，样品血清OD值>0.42，判为阳性。

1.2.3 组织样本PCR方法检测 参照国家标准(GB/T21674-2008)猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法。

1.2.3.1 样品处理及DNA模板提取 取待检组织0.2 g左右加入2 mL消化液研磨，待研磨好后取100 μL置于1.5 mL离心管中，再加入500 μL消化液和10 μL 20 g/L蛋白酶k溶液，混匀后置于55水浴中4 h～6 h。每管加入600 μL 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒混匀，4℃、13 000 r/min离心10 min。取上清500 μL置于新的1.5 mL离心管中，每管加入等体积的异丙醇，混匀后置-70℃冰箱中30 min，取出融化后，4℃、20 000 r/min离心15 min。弃上清，沿管壁缓慢滴加1 mL -20℃预冷的750 mL/L乙醇，轻轻旋转管壁洗涤1周后倒掉乙醇，倒扣于吸水纸上15 min左右。每管加入50 μL灭菌去离子水溶解沉淀，作模板备用。

1.2.3.2 PCR扩增体系及电泳 8 μL灭菌去离子水，2.5 mmol/L dNTP、15 mmol/L氯化镁、10倍PCR缓冲液、0.5 U/μLTaqDNA聚合酶、10 pmol/μL PCV引物各2 μL，DNA模板2 μL，混匀。94℃ 30 s、62℃ 45 s、72℃ 45 s,35个循环;延伸10 min。取15 μL扩增产物加3 μL上样缓冲液混匀，点到10 g/L琼脂糖凝胶板中， 5 V/cm电压40 min左右观察。被检样品出现652 bp扩增带判为PCV1阳性，出现1 154 bp扩增带判为PCV2阳性。

2 结果

2.1 血清样本ELISA检测结果

2.1.1 总样本ELISA检测结果 2014年1月至2015年12月共采集大庆市5区4县总血清样本649份，经猪PCV2 ELISA抗体检测，阳性样本355份，平均阳性率54.70%，阳性村屯/猪场35个，平均阳性率63.64%。感染范围包括5区4县所有抽检的9个地区，说明大庆市猪PCV2感染已经较为普遍。

2.1.2 不同地区样本ELISA检测结果 本次血清样品按地区进行统计，LDX和SET阳性率较高，ZYX和DMX相对较低，见表1。

表1 不同地区PCV2抗体检测结果

由表1可知，大庆市猪PCV2感染很不均衡，除ZYX外，其他地区已经有超过50%的检测村屯/猪场被感染，且样品阳性率较高，进一步说明大庆市猪PCV2自然感染较为普遍。

2.1.3 不同日龄样本ELISA检测结果 根据不同日龄把猪群分成断奶仔猪、育肥猪和母猪，据此进行统计，育肥猪阳性率最高，仔猪最低，见表2。

由表2可知，无论村屯/猪场阳性率，还是样品阳性率，育肥猪都明显高于断奶仔猪和繁殖母猪，且育肥猪村屯/猪场阳性率已达到80%，样品阳性率达到70%。断奶仔猪和繁殖母猪与育肥猪相比，虽然相对较低，但村屯/猪场阳性率也在60%左右，样品阳性率也已超过了50%。

2.1.4 不同时间样本ELISA检测结果 按时间统计，村屯/猪场阳性率和样品阳性率都在逐年增加，见表3。

表2 不同日龄PCV2抗体检测结果

表3 不同年份PCV2抗体检测结果

由表3可知，2015年大庆市猪群PCV2样品阳性率已达60%以上，村屯/猪场阳性率更已超过70%，都明显高于2014年，感染强度呈逐年递增趋势。

2.2 组织样本PCR检测结果

2.2.1 总样本PCR检测结果 2014年1月至2015年12月共采样31次，采集6家屠宰场和5家病猪场组织样本448套，经PCR扩增检测，PCV1阳性组织样本20套，平均阳性率4.46%，阳性次数8次，次平均阳性率25.81%。PCV2阳性组织样本100套，平均阳性率22.32%，阳性次数25次，次平均阳性率80.65%，见图1、表4和表5。

PCV1是非致病性病毒，一般认为猪群带毒较为普遍。由表4可知，本次分子流行病学调查表明，PCV1阳性批次只有25.81%，样品阳性率更少，只有4.46%，都明显低于PCV2，说明大庆市及周边地区PCV1感染率不高，群内感染更低，这与传统看法不符。

PCV2是致病性病毒，呈世界分布，世界各地及我国部分地区流调表明，猪群感染较为普遍，由表5可知，本次分子流调显示，大庆市及周边地区PCV2阳性批次高达80.65%，样品阳性率也达到22.32%，都明显高于PCV1感染，说明大庆市及周边地区PCV2感染已较为普遍。

2.PCV1阳性样本；5、8、9.PCV2阳性样本；1、3、4、6、7.阴性样本；M.DNA标准DL 2 000

2.Positive sample of PCV1; 5,8,9.Positive samples of PCV2；1,3,4,6,7.Negative control; M.DNA Marker DL 2 000

图1 猪圆环病毒PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification results of PCV

2.2.2 不同地区样本PCR检测结果 本次组织样品按地区进行统计，各地PCV1样品阳性率普遍较低，但批次阳性率差别较大，见表6；各地PCV2样品阳性率虽高低不等，但批次阳性率普遍较高，见表7。

由表6可知，大庆市及周边地区PCV1感染并不普遍，有些地区并未检出阳性样品，批次阳性率较高的地区只有DMX、ZZX和LFQ，平均阳性率只有25.81%；样品阳性率更低，平均阳性率只有4.46%，但本表并未表现出单群阳性率，本次组织样品流调，大庆市PCV1单群阳性率最高达40%。

由表7可知，大庆市及周边地区PCV2感染已较普遍，只有SET未检出，其他地区猪群基本都被感染，且批次阳性率普遍较高，有4个地区批次阳性率达100%。样品阳性率也较不平衡，虽然平均阳性率达22.32%，但周边地区阳性率高达69.23%，显著高于大庆市。

表4 PCV1总样本PCR检测结果

表5 PCV2总样本PCR检测结果

表6 不同地区PCV1 PCR检测结果

表7 不同地区PCV2 PCR检测结果

2.2.3 不同时间样本PCR检测结果 本次组织样品按时间进行统计，2年间PCV1和PCV2阳性率变化不大，见表8和表9。

由表8可知，本次组织样品流行病学调查，大庆市及周边地区PCV1批次阳性率不高，只有25.81%，样品阳性率更低，只有4.46%，且两年间没有明显变化。

由表9可知，2014年和2015年，大庆市及周边采样，PCV2批次阳性率和样品阳性率都有所下降，与血清学流调结果不一致。样品阳性率与血清学流调比较，也明显低于血清学流调。

表8 不同时间PCV1 PCR检测结果

表9 不同时间PCV2 PCR检测结果

3 讨论

猪PCV1是从污染的猪肾传代细胞系(PK-15)中发现的，一般认为不引起细胞变化，对猪无致病性，在其它多种病毒感染的的情况下有无协同致病性目前尚不十分清楚，研究报道也较少。但Krakowka等[7]用体外细胞传代的PCV1和猪细小病毒(PPV)混合感染1日龄新生仔猪，有1头仔猪出现了PPV血症，结肠袢出现肉芽肿性淋巴结炎，提示PCV1在混合感染中可能有一定作用。Saha D等[8]报道，PCV1感染能引起猪胚胎肺出现病理变化，同样提示PCV1可能具有潜在的致病性[3]。而Allang G M等[9]报道，可在流产与死亡的胎儿中检到PCV1，更提示其可垂直传播。因此，猪群PCV1感染已引起人们广泛关注。另外，一般认为猪群PCV1带毒比较普遍，阳性率从10%到100%不等[3]，但本次调查，PCV1阳性批次不高，只有25.81%，样品平均阳性率更少，仅为4.46%，与传统看法不符，更远低于PCV2感染。

进入21世纪以来，我国学者开始关注猪PCV2在猪群中的感染情况，并对部分地区做了流行病学调查。2007年，熊江林等[10]对鄂西北地区猪群进行了血清检测，样品阳性率为73.4%(207/282)，猪场阳性率为82.9%(29/35)；2008年李龙等[11]对重庆武隆县猪群进行了血清检测，断奶仔猪阳性率为76.6%(36/47)，育肥猪阳性率为74.2%(92/124)经产母猪阳性率为86.2%(75/87)；2009年，廖荣斌等[12]对湖北、湖南等十多个省送检的病料和血清进行了病原学和血清学检测，样品阳性率为35.05%(687/1 960)，猪场阳性率为58.86%(249/423)。以上调研说明我国猪场PCV2感染已较普遍，群内感染密度较大，已严重威胁畜牧业生产。在国外，20世纪90年代，Edwards S等[13]报道，英国和北爱尔兰猪血清抗体阳性率分别为86%和92%；Ellis J等[14]报道，德国屠宰场和2岁～3岁繁殖猪，血清抗体阳性率达85%，感染密度更大。本次调查，共采集大庆市5区4县55个未免疫PCV2疫苗村屯/猪场猪只血清样本649份，平均阳性率54.70%(355/649)，村屯/猪场阳性率为63.64%(35/55)，虽然没有达到国外那么高的阳性率，与熊江林和李龙等报道相比，也有明显降低，但与廖荣斌报道相比，阳性率明显增高，说明大庆市猪群PCV2感染已比较普遍。

关于猪PCV2感染分子生物学(PCR)检测，2008年至2010年，吴瑷等[15]对江苏金华地区疑似组织病料进行了检测，样品感染率为59.8%(61/102)；2011年，刘涛等[16]对河南信阳地区220份(50份是血清)病料进行了检测，感染率36.8%(81/220)；2012年，李海超等[6]对山东、广西等八个省送检的病料进行了检测，样品总感染率为71.4%(162/227)，其中安徽最高，达100%(11/11)，山东最低，为50%(8/16)。本次调查448套组织样品中，PCR扩增阳性率仅为22.32%(100/448)，明显低于上述报道，但本次检测样品中，只有13套来自临床疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征发病猪群，其他来源于屠宰场的临床健康猪，在13套有临床症状的组织样品中，有3套阳性，阳性率为23.08%，较接近刘涛的检测结果，明显低于吴瑷和李海超的报道。分子生物学检测也充分说明大庆市及周边地区猪群中，猪PCV2感染已比较普遍。

本次流行病学调查按时间比较，2014年与2015年PCV2组织样品阳性率虽无明显差异，但血清样品阳性率有逐年递增趋势，2015年血清样品阳性率已达60%以上，这在日常防控工作应引起高度重视。当然对单纯的病原来说，做适当的主动免疫，防控效果明显，但由猪PCV2参与引起的疾病症候群较为复杂，人们对于PCV2的致病机理、免疫抑制机理以及引起的各种临床症状的机理尚未达成统一的认识，对其他疾病发生的促进作用尚有争议[17]，也尚未完全了解，因此不能单纯依赖特定疫苗。而且目前疫苗免疫，虽在一定程度上降低了PCV2感染猪群的临床症状，提高了猪的生产性能，但疫苗免疫并不能完全阻断传播，亦不能清除体内已感染的病毒[18]。因此，在猪群PCV2感染防控工作中，应建立综合性防控机制，加强日常饲养管理和卫生消毒工作，适当增加药物预防，控制混合感染和继发感染，只有在污染严重的区域才建议有针对性的实施疫苗免疫防控。总之，增强整体防控意识，对稳定疫情，控制扩散有重要的指导意义。

[1] Ellis J,Krakiwka S,Lairmore M,et al.Reproduction of lesion of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobioti piglets[J].J Vet Diagn Invest,1999,11(1):3-14.

[2] Meehan B M,Meneilly F,Todd D,et al.Characterzation of novel circovirus DNAs associate with wasting syndromes in pigs[J].J Gen Virol,1998,79(Pt9):2171-2179.

[3] 于红欣，王立娇，孟凡伟，等.猪圆环病毒1型real-time PCR检查方法的建立[J].中国兽医科学，2014,44(10):1036-1041.

[4] 梁望旺，曾 政，吴胜昔，等.重庆地区猪圆环病毒2型的分离鉴定与序列分析[J].动物医学进展，2013,34(12):55-59.

[5] 葛 猛，杨 阳，蒋重合，等.猪圆环病毒2抗体水平的监测及意义[J].湖南畜牧兽医， 2009(3)：8-10.

[6] 李海超，王 娟，李一经，等.八省份猪圆环病毒2型与猪细环病毒混合感染的调查[J].中国兽医科技，2013,43(12):1313-1319.

[7] Krakowka S,Ellis J A,Meehan B,et al.Viral wasting syndrome of swine:experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus 1[J].Vet Pathol,2000,37(3):254-263.

[8] Saha D,Lefebvre D J,Ducatelle R,et al.Outcome of experimental porcine circovirus type 1 infections in mid-gestational porcine foetuses[J].BMC Vet Res,2011,7(1):64.

[9] Allan G M,Mcneilly Y F,Cassidy J P,et al.Pathogenesis of porcine circovirus:experimental infection of colostrums deprived piglets and examination of pig foetal material[J].Vet Microbiol,1995,44(1):49-64.

[10] 熊江林，周华林，王长义，等.鄂西北地区猪圆环病毒2型抗体水平监测[J].中国畜牧兽医，2008,35(9)：96-97.

[11] 李 龙，张 奎.猪圆环病毒2型的血清流行病学调查[J].中国畜牧兽医，2010,37(1)：182-183.

[12] 廖荣斌，赵洪翠，李文涛，等.猪圆环病毒病的流行病学调查[J].养猪,2011(1)：81-82.

[13] Edwards S,Sandsj J.Evidence of circovirus infection in British pigs[J].Vet Rec,1994,134:680-681.

[14] Ellis J,Hassard L,Clark E,et al.Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Can Vet J,1998,39:44-51.

[15] 吴 瑷，范红结，李君荣，等.金华地区猪圆环病毒病病原流行病学调查[J].家畜生态学报，2010,31(6)：79-82.

[16] 刘 涛，王 瑞，曲哲会，等.信阳地区猪圆环病毒病流行病学调查[J].黑龙江畜牧兽医，2013,3(上)：101-102.

[17] 李海超，王 娟，黄秀梅，等.猪圆环病毒2型免疫应答机制研究进展[J].动物医学进展，2014,35(2):105-109.

[18] 刘建波，张 辉，刘长明.猪圆环病毒的流行趋势与防控对策[J].动物医学进展，2014,35(1):111-115.

Study on PCV Infection Situation of Non Immune Pigs in Daqing City and Surrounding Areas

ZHAI Bao-ku，TAN Hai-dong，ZHANG Guan-qun

(DaqingCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Daqing,Heilongjiang，163311,China)

The experiment was conducted to detect the infection situation of PCV in pigs in Daqing city and surrounding areas.649 serum samples from 55 villages or pig farms (non-immune pigs) were used to test PCV2 antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the 488 tissue samples from 5 sick-pig farms and 6 slaughterhouses (PCV2 immune pigs) were used to test PCV1 or PCV2 by polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the average positive rate of PCV2 antibodies was 54.70% in the PCV2 non-immune pigs, including the positive rates of sera of weaned piglets, finishing pigs and breeding sows with 50.68%, 70.00% and 54.70%, respectively. The positive rate of PCV1 in tissues of pigs was 4.46%, that of PCV2 in tissues of pigs was 22.32%. The survey was likely to determine pandemic strain sequence and provide evidences for taking scientific prevention in Daqing area.

Porcine circovirus; enzyme-linked immunosorbent assay; polymerase chain reaction; epidemiology;investigation

2016-06-17

2014年黑龙江省级领军人才梯队后备带头人资助项目

翟宝库(1965-)，男，黑龙江大庆人，研究员级高级兽医师，主要从事动物疫病预防与控制工作。

S852.659.2;S858.28

B

1007-5038(2017)01-0119-06