乌司他丁对机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中TNF—α的影响

2017-02-27 22:16闵军潘定斌雷霆
中国医学创新 2016年32期
关键词:乌司他丁

闵军 潘定斌 雷霆

【摘要】 目的:建立机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织,观察TNF-α在机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中TNF-α的变化规律,探讨乌司他丁对呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)的治疗机制是否与抑制TNF-α的活化有关。方法:采用大潮气量通气建立呼吸机相关肺损伤兔模型,模型成立后30、60、120、180、240 min,抽取动脉血作血气分析,采用ELISA法检测血清肺组织中TNF-α的含量,采用HE染色观察肺组织病理变化,运用Real-time PCR、Western Blot检测肺组织中TNF-αRNA、蛋白的表达。结果:家兔在大潮气量机械通气后,随着时间的增加血清中、肺组织中TNF-α表达显著增加,而采呼吸机相关性肺损伤模型兔在使用乌司他丁干预后,动脉血中的PaO2较前有所回升,血清与肺组织中TNF-αmRNA与蛋白的表达同大潮氣量组相比有明显著上升(P<0.05)。结论:乌司他丁对呼吸机相关性肺损伤有保护作用,其机制可能是通过下调TNF-α的表达,抑制炎症反应来实现的。

【关键词】 乌司他丁; 呼吸机相关性肺损伤; 大潮气量; TNF-α

【Abstract】 Objective:The establishment of ventilator induced lung injury in a rabbit model of lung tissue,to observe the changes of TNF-α in mechanical ventilation induced lung injury model of rabbit lung tissue alpha,to explore the therapeutic mechanism of Ulinastatin on VILI and TNF-α.Method:The injury rabbit model of high tidal volume ventilation was established,after 30,60,120,180 and 240 min,arterial blood for blood gas analysis.TNF-α in serumwere measured by ELISA.The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining.The expression of TNF-αRNA and protein in lung tissue was detected by PCR Real-time and Blot Western.Result:After mechanical ventilation,the expression of TNF-α in serum and lung tissue increased significantly.Ulinastatin interved ventilator induced lung injury model in rabbits and rabbit arterial blood PaO2 increased,in serum and lung tissue TNF-α expression were compared with those of the earlier high tidal volume group improved significantly(P<0.05).Conclusion:Ulinastatin on ventilator induced lung injury has a protective effect, he mechanism may be by down regulating the expression of TNF-α,inhibit inflammatory reaction to achieve.

【Key words】 Ulinastatin; Ventilator associated lung injury; Tidal volume; TNF-α

First-authors address:The Second Hospital of Fuzhou Affiliated to Xiamen University,Fuzhou 350007,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.005

呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)是机械通气最严重的并发症之一,主要由于过度机械通气诱发或引起的急性肺损伤,危害性大,如果发现和处理不当可导致患者死亡[1]。VILI属于急性肺损伤,中性粒细胞、单核巨噬细胞等免疫细胞会在损伤后于肺内聚集,并释放的肿瘤坏死因子TNF-α等众多炎性介质,并启动早期炎症反应,而TNF-α等炎症因子又对炎症反应的维持起重要作用[2-3]。大潮气量机械通气致呼吸机相关肺损伤时在继发的急性炎症反应的始动与发展环节中起到关键作用。乌司他丁对TNF-α等炎症因子具有抑制作用,能减轻体内的炎症反应,值得研究。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是由男性尿液中提取的丝氨酸蛋白酶抑制剂,分子量为67 kD,对TNF-α等炎症因子具有抑制作用,从而减轻炎症反应[4-5]。本研究观察TNF-α在机械通气相关性肺损伤模型兔肺组织中的变化规律,探讨乌司他丁对VILI的治疗机制是否与抑制TNF-α的活化有关,并观察乌司他丁对VILI的疗效,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 雄性3月龄新西兰家兔24只(清洁级),体重(2.50±0.48)kg[动物合格证:SCXK(沪)2004-0003,上海西普尔-必凯公司]。乌司他丁(国药准字H19990133)300万单位。

1.2 实验仪器与试剂 DEVIBISS公司NEB-2000呼吸机;血气ABL800血气分析仪;PE生物9600DNA扩增仪;ABI7500型实时定量PCR仪;TNF-αELISA检测试剂盒(福州迈新生物技术公司);RR036A反转录试剂盒、SYBR?Green I RR82LR(Takara) (大连宝生物工程公司);考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(建成生物研究所);TNF-α抗体(美国abcam公司),β-actin抗体(美国CST公司),Western Breeze(美国invitrogen公司),PVDF膜(Amersham公司)。

1.3 方法

1.3.1 干预前准备 耳缘静脉进针,戊巴比妥钠麻醉,行气管切开并插管,连接呼吸机。切开左侧皮肤分离颈总动脉进行动脉血采集。于右侧颈静脉置静脉套管针开放静脉通道,以每小时10 mL/kg持续输注葡萄糖生理盐水,补液并维持血压稳定。准备阶段的呼吸机通气方式:容量控制(CMV):VT 8 mL/kg,FiO2∶40%,I∶E=1∶2,呼氣末正压(PEEP)3 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa),维持呼吸频率30~40次/min、PaCO2 5.32 kPa左右。

1.3.2 分组 稳定机械30 min后记录各项基础参数,并将此时时间点记录为0 h。将实验动物随机划分,每组8只,不同组予不同潮气量和通气时间:(1)常规潮气量组:继续初始通气条件VT 8 mL/kg通气。(2)大潮气量乌司他丁组:调节呼吸机至VT 40 mL/kg、呼吸频率8次/min。首次50 000 U/kg注射乌司他丁后,持续静脉输注5000 U/(kg·h)。(3)大潮气量对照组:调节呼吸机至VT 40 mL/kg、呼吸频率8次/min。持续静脉输注地塞米松0.5 mg/(kg·h)。

1.3.3 检测指标 在分组操作完成后30、60、120、180、240 min,抽取动脉血行血气分析,抽取静脉血检测血清中TNF-α的含量。取血完处死后取肺组织,用于mRNA与蛋白的检测。

1.3.3.1 血清肺组织中TNF-α含量的检测 静脉血离心取血清,肺组织液氮捣碎匀浆于组织稀释液中,试剂盒标准品分别加入96孔板上。并先后加入生物素、酶标底物,37 ℃温育60 min。加入终止液终止反应,显色15 min后,于酶标仪450 nm读取OD值。

1.3.3.2 肺组织TNF-α蛋白的检测 提取肺组织的蛋白,测定蛋白浓度后,以30 μg/道上样,进行SDS-PGEE凝胶电泳, 然后采用半干转将胶上蛋白印至PVDF膜。室温封闭30 min。将1∶5000稀释的抗体封闭膜1 h,洗膜6次后将二抗室温封闭30 min,后再洗膜6次。将发光底物与膜在室温下孵育5 min,曝光、显影。应用Phoretix 1D生物电泳图象分析系统读每个条带的光密度值。

1.3.3.3 肺组织TNF-αmRNA的检测 TNF-α引物:F 5CGCAAGAGTGTCTGGCGCAA 3,R 5GGATGACGCG GAG ACGGA3,产物长度145 bp。内参β-actin引物:F 5AGGCTGTCTTGTCCTGTA 3,R 5ATGTCACGCCAGATTTCC 3,产物长度176 bp。采用Trizol法提取肺组织RNA,抽提后的RNA加入溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳,检验RNA是否降解,在确定无降解后测定RNA浓度,按试剂盒说明书步骤进行逆转录。逆转录后在ABI7500上扩增,得到扩增曲线与CT值。采用2-△△CT计算mRNA的表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,比较采用t检验;计数资料以率(%)表示,比较采用 字2检验。ONE-WAY ANOVA(单向方差分析)组间数据比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血气改变与常规潮气量组比较 大潮气量对照组动物在创伤后30 min,PaO2显著降低(P<0.05),并在4 h内持续保持低水平。大潮气量乌司他丁组动物PaO2于30 min先降低,1 h后持续有所升高,与大潮气量对照组比较有显著升高但低于同时期常规潮气量组(P<0.05)。见表1。

2.2 血清肺组织中TNF-α含量的检测结果 创伤后大潮气量组血清在TNF-α的含量逐渐升高,乌司他丁组明显低于对照组组(P<0.05)。同时期常规潮气量组血清中TNF-α则无明显变化,且各时间段无明显变化(P>0.05),见表2。而肺组织中TNF-α的表达量以大潮气量对照组最高为(98.43±2.99)pg/mL,大潮气量乌司他丁组次之为(89.69±6.38)pg/mL,常规潮气量组最低为(75.32±3.21)pg/mL,其他两组与同时期常规潮气量组比较(P<0.05),其他两组与同时期对照组比较(P<0.05)。

2.3 不同组别肺组织中TNF-αmRNA的表达 qPCR扩增曲线说明所采用的体系和条件符合要求(图1)。同时,溶解曲线表明为特异性扩增(图2)。肺组织中TNF-αmRNA的表达以大潮气量对照组最高为1,大潮气量乌司他丁组次之为(0.534±0.033),常规潮气量组最低为(0.774±0.042),各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4 不同组别肺组织中TNF-α蛋白的表达 大潮气量对照组肺组织中TNF-α蛋白表达含量最高为(0.843±0.032),大潮气量乌司他丁组次之为(0.489±0.015),常规潮气量组最低为(0.194±0.028),各组比较差异均有统计学意义(P<0.05),见图3。

3 讨论

呼吸机所致肺损伤(ventilator-induced lung injury,VILI)是由于机械通气导致肺损伤的一种严重并发症,病理上显现为弥漫性肺损伤:肺泡外气体、肺泡上皮与血管内皮的广泛破坏、肺水肿和肺不张等。VILI的发病机制复杂:除气压伤、容量伤、肺萎陷伤外,免疫细胞和炎症因子介导的局部炎症反应也参与其中[7-9]。当肺内细胞感知机械力量刺激后,通过细胞内信号传导激活炎症细胞,诱导其释放大量炎症因子,导致炎症级联反应的发生,大量炎症介质释放,并通过肺并进入血液循环,最终促进和加重SRIS及MOF[10-11]。而其中中性粒细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞分泌的TNF-α等炎性介质对启动早期炎症级联反应与炎症反应的维持起着重要作用[12-14]。

TNF是主要由激活的中性粒细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞分泌的Ⅱ型膜蛋白,可与细胞膜上的特异性受体结合,实现细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症等生物学效应的促进作用。而在TNF家族中TNF-α不但是炎症反应过程中重要的启动因子,还可诱导炎症相关的细胞因子、受体等合成和表达。同时可激活NF-κB信号通路,诱导肺泡上皮细胞分泌炎症介质,并相互作用。总之在受到过度机械通气时肺泡上皮细胞受到牵拉而变形,继而发生机械应力衰竭,并伴随胞膜破坏,导致炎性细胞分泌TNF-α增多,介导了NF-κB信号通路的活化,最终诱导肺内细胞的凋亡[15-17]。

本研究结果显示:VILI损伤模型兔在大潮气量机械通气后,随着时间的增加,血清中、肺组织中TNF-α表达显著增加,提示其在VILI的发展过程中可能起到一定的作用。肺组织TNF-α表达在VILI的发生、发展中起重要作用,乌司他丁对VILI有保护作用,其机制可能是通过下调TNF-α的表达,抑制NF-κB信號通路的活化来实现的[18-20]。但是,参与VILI的炎症因子众多,TNF-α与其他细胞因子也有协同作用,转录水平的信号调控网络复杂。乌司他丁对肺的保护作用是否还有其他的信号通路传导参与,仍需要更进一步的研究。

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(收稿日期:2016-05-19) (本文編辑:程旭然)

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