荷斯坦牛TLR6基因多态性分析

周秀敏，李强子，毕英杰，任卫合，张 丽（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

遗传育种与繁殖

荷斯坦牛TLR6基因多态性分析

周秀敏，李强子，毕英杰，任卫合，张 丽
（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

为研究中国荷斯坦牛TLR6基因的多态性，确定其等位基因数以及核苷酸变异位点，探讨其遗传特性，采用PCR-SSCP技术对303头荷斯坦牛的TLR6基因进行了遗传多态性检测。结果表明：TLR6基因在扩增区域的209 bp处发生G→A的错义突变，导致TLR6蛋白中第70位天冬氨酸（Asp）变为天冬酰胺（Asn），并产生AA、BB、AB三种基因型，基因型频率分别为0.214 5、0.122 1和0.663 4，经χ2适合性检验，荷斯坦牛在该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。说明中国荷斯坦牛TLR6基因多态性丰富，该位点可以作为荷斯坦牛抗病育种的分子标记位点。

荷斯坦牛；TLR6基因；遗传多态性

TLRs是一类比较保守模式识别受体，能在微生物病原体感染机体早期做出免疫应答，是机体天然免疫防御中的重要因子［1］，可直接识别病原体的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），进而启动免疫应答并建立获得性免疫。TLR6作为TLRs家族一员，通过激活巨噬细胞、单核细胞等抗原递呈细胞来对病原体做出免疫应答［2］。Vikki等［3］研究表明，TLR6不能直接识别病原体，而是作为辅助因子增强TLR2对某些病原体PAMPs的识别。研究发现，TLR6基因位于牛的第6号染色体上，包含2个外显子和1个内含子［4］。李强子等［5］通过对TLR6基因生物信息学分析表明，该基因能对牛的抗病力和生产性能起作用。而TLR6基因也是奶牛乳房炎抗性相关的候选基因［6］。

近年来，国内对荷斯坦牛TLRs的研究大部分集中在TLR2和TLR4上，而对于TLR6的研究仅见储明星［6］的相关研究。本实验通过PCR-SSCP技术对荷斯坦牛TLR6基因进行多态性分析，旨在丰富荷斯坦牛TLR6基因库，并为抗病性基因的筛选提供分子理论资料。

1 材料和方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

血样采自宁夏贺兰山奶业有限公司的303头中国荷斯坦牛，用医用采血管尾静脉采血10mL，-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法，从备用冻存血液样本中提取总基因组DNA，去离子水溶解稀释，-20℃保存备用。

1.2 引物设计与PCR-SSCP

根据GenBank中已公布的荷斯坦牛TLR6基因的mRNA序列（登录号：NM_001001159），用Primer6.0软件设计1对特异性引物，用于扩增荷斯坦牛TLR6基因序列。引物序列为：F：5′-CAACTTGACCCAACTGAAT-3′；R：5′-TTGTAAGCACGCTAAACTA-3′，引物由大连宝生物公司合成，扩增片段为241 bp。PCR扩增体系总体积为20μL：基因组DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Taq PCRMasterMix 10μL，ddH2O 6μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存，并采用1%琼脂糖凝胶对其进行扩增结果检测。

取3μL的PCR产物，加入7μL变性上样缓冲液（0.025%溴酚蓝、98%去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰），98℃变性10min后再立即冰浴10 min。将变性后的PCR产物点样至10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上（Acr∶Scr=39∶1），160V电压室温电泳2～3 h。结束后用银染法染色，确定PCR产物的基因型。PCR扩增产物经过SSCP确定基因型后，用试剂盒回收，对于纯合子PCR产物送北京华大公司测序。对于杂合子个体，则参照Hu等［7］介绍的方法处理。

1.3 统计分析

使用BioEdit和Lasergene软件分析测序峰图并判断突变位点及突变方式。利用Popgene32软件计算出TLR6基因不同突变位点的等位基因频率、基因型频率、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）和多态信息含量（PIC），并对该位点基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验及核苷酸序列的比对分析。

2 结果与分析

2.1 中国荷斯坦牛TLR6基因PCR扩增

对303头荷斯坦牛的DNA样品扩增后，经1%琼脂糖凝胶（100V，30min）电泳检测后均得到一条如图1所示的特异性好、条带清晰、长度约241 bp的PCR产物，且与预期目的片段大小一致。可以用于SSCP检测。

图1 荷斯坦牛TLR6基因PCR扩增产物检测结果

2.2 中国荷斯坦牛TLR6基因PCR-SSCP检测及序列测定分析

荷斯坦牛TLR6基因扩增序列区域共检测到2种等位基因A和B，形成AA、BB、AB三种基因型（图2），其中等位基因A和B均具有纯合型个体。PCR产物纯化后的测序结果显示，扩增片段长度为241 bp，在GenBank中基因引物扩增区域核苷酸序列与牛TLR6基因序列的同源性为97%以上，这表明扩增产物的确为荷斯坦牛TLR6基因，而不是其他的TLR6基因。与普通牛TLR6基因（GenBank no.NM_001001159）序列对比发现，在扩增区域的209 bp处发生了碱基G→A的碱基突变（如图3），使编码蛋白质的氨基酸由酸性天冬氨酸（Asp）变为极性中性天冬酰胺（Asn）（如图4）。

图2 荷斯坦牛TLR6基因第3外显子部分序列PCR产物SSCP检测结果

图3 荷斯坦牛和普通牛TLR6等位基因序列比对

图4 荷斯坦牛和普通牛TLR6基因氨基酸序列比对

2.3 遗传参数分析

统计分析结果表明，等位基因A和B的频率分别为0.546 2和0.453 8，基因型AA、BB和AB的频率分别为0.214 5、0.122 1和0.663 4。有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、纯合度（Ho）和多态信息含量（PIC）分别为1.983 1、0.663 4、0.336 6和0.372 9。PIC介于0.25和0.5之间，属中度多态。经χ2适合性检测表明，荷斯坦牛在该位点已偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。

3 讨论

近年来，国内外对TLR6基因的多态性报道相对较少。Kesh等［8］和Pierik等［9］在人的TLR6基因中共发现了4个SNPs。Opsal等［10］在挪威红牛TLR6基因中发现了1个SNP。Shinkai等［11-12］在猪的TLR6基因中发现了11个SNPs。储明星等［6］在荷斯坦牛TLR6基因中检测到6个SNPs。魏麟等［13］在猪的TLR6基因中检测到1个SNPs。Xiao［14］等在广东人TLR6基因中发现了1个SNPs。

本研究在中国荷斯坦牛TLR6基因扩增序列区域检测到G→A错义突变，引起第70位非极性酸性天冬氨酸（Asp）变为极性中性天冬酰胺（Asn）。蛋白质的结构决定其功能，由于编码蛋白质活性中心的大多数氨基酸残基为非极性的疏水氨基酸，这些小基团位置的变化，很有可能改变该蛋白质的活性中心构象，甚至空间构象，因而会进一步影响其功能的发挥。但该研究中两处发生替换的氨基酸的极性水平发生了改变，有可能导致其编码蛋白质的高级结构发生改变，进而使荷斯坦牛的信号转导、胁迫应答和免疫应答等的生理功能发生改变。

在遗传多态性分析中，可以将有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）和多态信息含量（PIC）作为衡量某群体遗传变异大小的指标，其中指标数值越大，遗传变异越高，选择的潜力就越大。该荷斯坦牛群体在该位点表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），该突变位点已偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05），说明群体的遗传变异较大，受到的选择压力相对较大，因此该位点可以作为荷斯坦牛泌乳性状的分子标记位点。

［1］Buwitt-Beckmann U，Heine H，Wiesmüller K H，et al.TLR1-and TLR6-independent recognition of bacterial lipopeptides［J］.Journal of BiologicalChemistry，2006，281（14）：9049-9057.

［2］Jack C S，Arbour N，Manusow J，et al.TLR signaling tailors innate imune responses in humanmicrogliaand astrocytes［J］.The Journalof Immunology，2005，175（7）：4320-4330.

［3］Abrahams V M，Aldo P B，Murphy S P，et al.TLR6 modulates first trimester trophoblast responses to peptidoglycan［J］.The Journal of Immunology，2008，180（9）：6035-6043.

［4］McGuire K，JonesM，Werling D，etal.Radiation hybridmapping of all 10 characterized bovine Toll-like receptors［J］.Animal Genetics，2006，37（1）：47-50.

［5］李强子，朱国强，刘吴鑫，等.荷斯坦牛TLR6基因CDS区的生物信息学分析［J］.江苏农业学报，2016，32（3）：608-614.

［6］储明星，李春苗，石万海，等.荷斯坦母牛TLR6基因多态性及其与体细胞评分关系的研究［J］.畜牧兽医学报，2009，40（11）：1621-1629.

［7］Hu J，Zhou H，Smyth A，et al.Polymorphism of the bovine ADRB3 gene［J］.Molecular Biology Reports，2010，37（7）：3389-3392.

［8］Kesh S，Mensah N Y A A，Pelerlongo P，et al.TLR1 and TLR6 polymorphisms are associated with susceptibility to invasive aspergillosis after allogeneic stem cell transplantation［J］.Annals of theNew York Academy ofSciences，2005，1062（1）：95-103.

［9］Pierik M，Joossens S，Van Steen K，et al.Toll-like receptor-1，-2，and-6 polymorphisms influence disease extension in inflammatory boweldiseases［J］.Inflamm BowelDis，2006，12（1）：1-8.

［10］Opsal M A，Våge D I，Hayes B，et al.Genomic organization and transcript profiling of the bovine toll-like receptor gene cluster TLR6-TLR1-TLR10［J］.Gene，2006，384：45-50.

［11］ShinkaiH，Muneta Y，Suzuki K，etal.Porcine Toll-like receptor 1，6，and 10 genes：complete sequencing of genomic region and expression analysis［J］.Mol Immunol，2006，43（9）：1474-1480.

［12］Shinkai H，Tanaka M，Morozumi T，et al.Biased distribution of single nucleotide polymorphisms（SNPs）in porcine Toll-like receptor 1（TLR1），TLR2，TLR4，TLR5，and TLR6 genes［J］.Immunogenetics，2006，58（4）：324-330.

［13］魏麟，陈斌，黎晓英，等.猪TLR6基因Msp I多态性与生长性状相关性研究［J］.中国农学通报，2011，27（11）：5-9.

［14］XiaoW J，Gong Y X，Liu ZH，etal.Singlenucleotide polymorphisms and haplotypes of TLR6 gene in Chinese Cantonese population［J］. International Journalof Immunogenetics，2010，37（4）：245-251.

Polym orphism of TLR6Gene in Chinese Holstein Cattle

Zhou Xiumin，LiQiangzi，Zhang Li，etal
（Collegeof Life Scienceand Engineering,NorthwestUniversity forNationalities,Lanzhou 730030,China）

Inorder tostudy thepolymorphism of TLR6gene in Holstein cattle,theblood samplesof303Holstein cattleweredetected bypolymerasechain reaction-singlestrand conformation polymorphism（PCR-SSCP）.The resultsshowed thattherewasamissense mutation ofG to A in the TLR6 gene,which led to the change ofaspartic acid to asparagine in the TLR6 protein,producing three genotypes（AA，BB，AB）with the frequenciesof0.2145，0.122 1and 0.663 4 respectively.Theχ2testindicated thatthegeneat this sitedeviated from Hardy-Weinbergequilibrium（P＜0.05）.Itwasconcluded that thepolymorphism of TLR6 genewas rich and the locuscould beused asamolecularmarker for resistancebreedingofHolstein cattle.

Holstein cattle；TLR6 gene；polymorphism

S826.2

A

2095-3887（2017）01-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.001

2016-10-30

西北民族大学引进人才科研项目（xbmuyjrc201316）；西北民族大学生命科学与工程学院众创空间扶持项目

周秀敏（1996-），女，在读本科生。

作者通信：张丽，Email：shiningstar2013@sina.cn