带血管腓骨复合异体骨重建节段性骨缺损动物模型建立

朱皓东 姬传磊 王臻 樊俊俊 贺杰 冯俊凯 刘冬 陈国景 李靖

. 论著 Original article .

带血管腓骨复合异体骨重建节段性骨缺损动物模型建立

朱皓东 姬传磊 王臻 樊俊俊 贺杰 冯俊凯 刘冬 陈国景 李靖

目的 本实验观察带血管腓骨复合异体骨重建节段性骨缺损动物模型建立。方法 选 52 只新西兰大白兔，对 18 只成年新西兰大白兔在全麻下无菌取双侧兔胫骨，取下的兔胫骨无菌下反复冲洗、处理髓腔，再放入无菌容器内在 -196 ℃ 液氮灭菌 40 min，常温下复温，作为实验用兔异体骨。再对另外 34 只新西兰大白兔分批在全麻下行单侧兔胫骨人为制造骨缺损，骨缺损范围约为 1.2～1.5 cm，再选取粗细、长度相同的兔异体胫骨复合兔自体带蒂腓骨瓣修复骨缺损，钢板固定，平均手术时间 1.5 h。结果 实验的 34 只兔术后单侧胫骨骨缺损用兔同种异体骨复合兔自体带蒂腓骨瓣修复骨缺损中，1 只兔在术中麻醉意外死亡，1 只在术后麻醉苏醒活动后出现肢体畸形，急查 X 线片显示：内固定断裂、骨头碎裂，对麻醉意外、内固定断裂、骨头碎裂的 2 只兔在实验中放弃。其余 32 只兔手术成功，术后复查 X 线片观察，兔胫骨骨缺损用兔同种异体骨复合兔自体带蒂腓骨瓣修复骨缺损后，有 3 只术后 5 个月复查 X 线片显示骨未愈合，其余 29 只骨完全愈合，愈合时间为平均 4 个月。结论 兔胫骨、腓骨解剖结构和人类胫骨、腓骨解剖结构类似，兔适合行自体带蒂腓骨瓣移植，不用行腓骨瓣血管吻合，腓骨有丰富血供，能促进异体骨与宿主骨愈合，腓骨愈合后能提供中晚期力学支撑。临床用同种异体骨复合自体带血管腓骨移植修复大段骨缺损手术方案与此动物实验模型相对应，该模型的建立为临床手术提供了更有力的依据。

腓骨；骨移植；同种异体复合组织移植物；骨重建

临床上由于创伤、骨感染、肿瘤、战时火器伤所致的大段骨缺损并不少见，目前采用的治疗方法主要为同种异体骨移植和带血管自体腓骨移植[1]。大段异体骨复合自体带血管腓骨移植修复四肢大段骨缺损，保存了大段异体骨的物理强度，并且可提供丰富血供加速异体骨活化促进骨愈合，很好地解决四肢大段骨缺损修复的难题[2]。现国内外用同种异体骨复合自体带血管腓骨修复大段骨缺损报道很多，但没有动物模型实验与临床相对应。本实验对34 只成年新西兰大白兔模型建立为大段骨缺损采用同种异体骨复合自体带血管腓骨移植修复骨缺损的临床应用提供依据。

资料与方法

一、一般资料

1. 材料和仪器：选取 52 只新西兰大白兔，3～4 个月龄，体重约 1.5～3.5 kg，雌雄性不限，购自第四军医大学动实验中心。刮勺、骨锉、指接骨钢板、螺丝钉、电钻、摆锯 ( 强生 )，该实验在第四军医大学外科实验中心完成。

2. 材料制备：先对 18 只成年新西兰大白兔在全麻下无菌取双侧兔胫骨剔除软组织 ( 图 1a )，取下的兔胫骨经过无菌反复冲洗、处理髓腔，庆大霉素混合液清洗 3 次，放入无菌容器内在 -196 ℃ 液氮灭菌 40 min，常温下复温，装袋，用60Co 灭菌 ( 照射72 h ) 后做细菌、厌氧菌培养，储存在 -80 ℃ 冰箱1 年 ( 抗原处理 )，作为实验兔异体骨。

二、动物模型建立

分批次取实验用兔 ( 34 只，右侧胫骨 19 例；左侧 15 例 )，称体重，于兔耳缘静脉注射 2% 戊巴比妥 1 ml / kg；盐酸赛拉嗪速眠新 0.3～0.4 ml / kg 肌肉注射进行全身麻醉，术中必要时可进行兔耳缘静脉追加戊巴比妥 ( 1 ml / kg ) 确保良好的麻醉状态，兔仰卧位四肢伸展，腿部去毛，采用 0.5% 碘伏消毒，铺无菌手术单。在胫骨前外侧处做一弧形切口长约4 cm ( 图 1b )，切开皮肤、皮下组织及深筋膜，显露胫骨远近端外侧。用摆锯分别在胫骨近端关节面下约 3.5～4.0 cm 处及远端截骨，制造 1.2～1.5 cm 胫骨骨缺损 ( 图 2a )，髓腔扩大后在近端自体胫骨后侧开小槽以防止复合时腓骨蒂部受压，再截取同等粗细、长度的兔异体胫骨 ( 图 2b )，截取的异体骨用骨刀、刮勺骨锉等将其表面和髓腔处理，后修整成规则的原始解剖形状。处理后的异体骨用过氧化氢、生理盐水反复清洗。外侧取同侧腓骨，取腓骨长度为制造的骨缺损长度的 2～3 倍作移植腓骨瓣。腓骨瓣游离后仅留血管蒂部与其相连，在腓骨瓣血管蒂一侧每隔 1 cm 用 5 号针头开孔，确保孔眼内有血液渗出。将腓骨瓣插入异体骨，确保血管蒂位于开槽处避免受压，接骨板固定 ( 图 3a、b )。缝合手术切口，平均手术时间 1.5 h。术后给庆大霉素 4 万单位肌注 1 次预防切口感染。

三、术后观察

1. X 线片复查：完成实验的 32 只术后当天和术后每月 X 线片复查 ( 图 4a、b )，观察异体骨复合自体腓骨瓣修复大段骨缺损愈合情况。

2. Van Gieson 染色：观察骨愈合情况。

结 果

纳入本研究的 34 只新西兰大白兔，1 只术中死于麻醉意外，1 只术后麻醉苏醒活动后出现肢体畸形，X 线片显示：内固定断裂、骨头碎裂，放弃实验。其余 32 只无局部感染与其它并发症，完成实验。

完成实验的 32 只中，29 只行异体骨复合带血管腓骨移植重建阶段骨缺损，异体骨与自体腓带血管骨与宿主骨骨痂形成良好，骨完全愈合 ( 图 5a，b )。其中 7 只在术后 3.8 个月骨完全愈合；5 只在术后4.3 个月骨完全愈合；8 只在术后 3.2 个月骨完全愈合；9 只在术后 4.5 个月骨完全愈合。3 只未愈合兔，术后每月摄 X 线片复查，直至术后 5 个月仍未见骨愈合迹象 ( 图 6a，b )。

图1 a：兔异体骨；b：术前切口设计 Fig.1 a: Rabbit allograft; b: Preoperative incision design图2 a：人为制造骨缺损；b：截取同等异体骨 Fig.2 a: Artif cial bone defect; b: The same allograft was captured

图3 a：游离带蒂腓骨；b：异体骨复合带血管腓骨重建钢板固定图4 a：术后 1 个月复查 X 线片；b：术后 4.5 个月复查 X 线片Fig.3 a: The free f bula; b: Reconstuction of the allograft combined wih vascular f bula, and the plate was f xedFig.4 a: The X-ray f lms were reviewed at 1 month after the operation; b: The X-ray f lms were reviewed at 4.5 months after the operation

图5 a：术后 4 个月骨完全愈合；b：Van Gieson 氏法染色骨完全愈合 ( × 20 )图6 a：术后 5 个月骨未愈合；b：Van Gieson 氏法染色骨未愈合 ( × 20 )Fig.5 a: Bone union was realized at 4 months after the operation; b: Van Gieson’s method of dyeing showed bone union completely ( × 20 )Fig.6 a: Bone nonunion was noticed at 5 months after the operation; b: Van Gieson’s method of dyeing showed bone nonunion ( × 20 )

讨 论

对于临床上用异体骨复合自体带血管腓骨、自体瘤骨复合带血管腓骨修复重建四肢大段骨缺损的方法和结果不断有报道，但没有动物实验模型与临床相对应。

本实验通过对新西兰大白兔同种异体骨复合自体带蒂腓骨瓣修复骨缺损，本次实验选取大白兔为实验对象，是因为大白兔胫、腓骨的解剖结构与人类胫、腓骨解剖结构相似，适合做自体腓骨移植，实验中自体带血管蒂腓骨瓣优点为：胫、腓骨在解剖结构相邻，行腓骨瓣复合异体骨修复骨缺损操作简单、方便，而带蒂腓骨瓣不用行腓动、静脉血管吻合，腓骨有血运丰富，术后血管危象几率低，腓骨成活几率高，促 进了异体骨与宿主骨愈合，对本次实验增加成功几率。目前临床对于骨缺损治疗方法主要有：自体骨移植、同种异体骨移植、生物医用材料 ( 人工骨 ) 填充骨缺损。而自体骨移植被认为是修复骨缺损的“金标准”，但是自体骨提供的植骨量、结构和强度是有限的，无法提供结构均相同的大段异体骨相比，后期存在移植骨易吸收、骨折等问题，但是同种异体骨在骨量、结构和强度可弥补这些缺陷。实验选兔同种异体骨复合自体腓骨瓣修复大段骨缺损实验模型的建立，根据本 次实验结论再次与临床相对应。在以前的临床报道中有单纯用异体骨移植修复骨缺损；有单纯用自体腓骨修复骨缺损，两者都有不足之处。

一、同种异体骨移植、骨未愈合原因分析

内固定固定稳定度差、实验兔剧烈运动，重建端不稳定，导致自体带血管腓骨发生血管危象，腓骨无血供，腓骨坏死，综合因素导致重建后异体骨、自体腓骨与宿主骨未愈合。

二、同种异体骨移植的优点与不足

1. 优点：人体同种异体骨移植不受形状与数量的限制，可达到及时的骨量要求，骨愈合过程与传统的大段自体移植骨类似，同种异体骨在修复骨缺损时它的支架、结构和强度作用大大解决了临床难题。

2. 不足：异体骨在无菌灭菌处理过程缺乏自身成骨作用，经骨库制备的同种异体骨细胞成分已死亡，无成骨能力，其愈合是依靠骨传导和骨诱导作用[3]。所以移植后骨愈合过程缓慢，骨易吸收、骨折、骨不愈合率高，远期效果不理想，不能早期负重[4]，单纯大段异体骨移植最后的结局往往失败，同种异体骨始终无法与自体骨移植相比，但同种异体骨移植临床效果并不亚于其它替代物[5]。同种异体骨由于具备低毒且较易被耐受，来源广泛，作为支架材料具有良好的结构和强度，为骨缺损修复的有效方法之一[6]。

三、自体带血管腓骨移植的优点与不足

1. 优点：自体骨移植素有“活骨移植”之称，在大段骨缺损时，受区血管和软组织条件具备者，行单纯患侧或健侧自体带血管腓骨移植[7]，修复骨缺损，自体腓骨移植包含有成骨活性的骨细胞，有丰富的血供，愈合过程由爬行替代可转化为一般的骨折愈合过程，成功率高，可一期修复大段骨缺损。

2. 不足：单纯自体带血管腓骨移植虽然修复是有了支架、骨愈合优势，但缺乏稳定、结构和强度，虽然有独立和丰富的血供，其愈合过程由爬行替代转化为一般 的骨折愈合过程愈合时间短，即使有感染、血供差的部位也能成活，其成功率高，能一期修复骨缺损，被誉为最佳骨移植，但数量有限，由于其结构的局限，不能早期负重[8-10]。

所以不管用单纯同种异体骨或自体腓骨移植修复骨缺损，都会存在不足，如果用同种异体骨与自体带血管腓骨结合起来修复骨缺损，两者优点相结合互补，解决了支架、结构、强度和骨愈合等难题，自体带血管腓骨移植包含有成骨活性的骨细胞，有丰富的血供，愈合过程由爬行替代可转化为一般的骨折愈合过程，成功率高，可一期修复大段骨缺损，异体骨骨量充足，结构和强度等优势，两者结合，在临床上不管是创伤、骨感染、肿瘤、战时火器伤所致的大段骨缺损修复重建方面解决了支架、结构、强度和骨愈合等难题。Capanna 等[11]在1993 年最早报道将异体骨和带血管腓骨复合的组合生物重建技术用于骨肿瘤切除后下肢大段骨缺损的重建。其中，异体骨提供骨量、早期力学支撑及对腓骨的保护，带血管腓骨促进了异体骨与宿主骨愈合，腓骨愈合后能提供中晚期力学支撑。组合方法通过取长补短达到最大程度功能恢复和降低并发症的目的。近年来与自体带血管腓骨组合修复大段骨缺损重建的方法和结果不断报道[12-16]。在肿瘤方面，用巴士灭活瘤骨、照射灭活瘤骨与带血管腓骨复合成为重要生物组合方式[17-19]。降低骨不连、骨折、感染等并发症，液氮自体瘤骨灭活复合自体带血管腓骨组合重建方式行肿瘤保肢，临床证实自体带血管腓骨利于复合体愈合[20]。

为了实验结果与临床相一致，而实验不可能在人体上进行观察研究。兔胫骨、腓骨解剖结构和人类胫骨、腓骨解剖结构类似，所以通过本研究观察到带血管腓骨复合异体骨重建节段性骨缺损，异体骨与自体骨的骨愈合机制、转归及组织学特点，通过本实验结果证实，由于自体腓骨能有血运丰富，腓骨成活几率高，加速了异体骨活化、促进了骨一期愈合，结合异体骨保存了大段异体骨的物理强度和保护了移植的腓骨。此实验模型的建立与临床手术技术的可行性，且为利用此次动物模型进行同种异体骨复合自体带血管腓骨修复大段骨缺损手术技术相对应。为临床提供了更有力的依据。

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( 本文编辑：裴艳宏 )

Reconstruction of segmental bone defect with vascular f bula compound allograft in the animal model

ZHU Hao-dong, JI Chuan-lei, WANG Zhen, FAN Jun-jun, HE Jie, FENG Jun-kai, LIU Dong, CHEN Guo-jing, LI Jing. Department of Orthopedic Oncology, Xijing Hospital, the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China

LI Jing, Email: zyfmmu@fnnu.edu.cn

ObjectiveTo observe reconstruction of segmental bone defect with vascular f bula compound allograft in the animal model.MethodsA total of 52 New Zealand white rabbits were selected, and bilateral tibia was taken from 18 adult New Zealand white rabbits under general anesthesia and sterile conditions. The removed tibia was repeatedly washed, and the tibial medullary cavity was processed under sterile conditions. It was put in a sterile container and underwent liquid nitrogen sterilization at minus 196 degrees Celsius within 40 minutes. And then it was rewarmed at room temperature, which was taken as the experimental rabbit allograft. Artif cial bone defects were made from the unilateral tibia of the other 34 New Zealand white rabbits under general anesthesia in batches, which were in the range of about 1.2 - 1.5 cm. The bone defects were repaired with the combination of allogeneic tibia and autologous tibia with pedicled f bular f ap of the same thickness and length, and the plate was f xed. The average operation time was 1.5 h.ResultsAmong the 34 experimental rabbits whose unilateral tibia bone defects were repaired with the combination of allogeneic tibia and autologous tibia with pedicled f bular f ap, 1 rabbit died in an intraoperative anesthesia accident, and 1 rabbit had limb deformities when it walked after waking from anesthesia after surgery. The X-ray was checked hurriedly, and breakage of internal f xation and bone fracture were found. The 2 rabbits with anesthesia accident, breakage of internal f xation and bone fracture were given up. Successful operations were realized in the other 32 rabbits. The postoperative X-ray showed that among the rabbits whose bone defects were repaired with the combination of allogeneic tibia and autologous tibia with pedicled f bular f ap, bone nonunion was noticed in 3 rabbits at 5 months after the operation, and bone union in the other 29 rabbits, with 4 months of healingtime.ConclusionsThrough this experiment, the anatomy of the rabbit tibia and f bula is similar to that of human tibia and f bula, and rabbits are suitable for autologous pedicled f bular f ap transplantation. Vascular anastomosis of the f bular f ap isn’t needed. The f bula with rich blood supply can promote the healing of allograft bone and host bone, and middle and late mechanical support can be provided after the healing of the f bula. Clinical surgery of massive bone defects with the combination of allogeneic bone and autologous bone with pedicled f bular f ap corresponds to the animal experimental model, which provides more powerful basis for clinical surgery.

Fibula; Bone transplantation; Composite tissue allografts; Bone remodeling

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.02.012

R683, R687.3

710032 西安，第四军医大学西京医院骨肿瘤科

李靖，Email: zyfmmu@fnnu.edu.cn.

2016-11-08 )