胚胎干细胞/诱导多能干细胞向间充质干细胞转化的研究进展

孙养鹏 张志光

（中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所，广东广州510055）

·综述·

胚胎干细胞/诱导多能干细胞向间充质干细胞转化的研究进展

孙养鹏 张志光

（中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院·口腔医学研究所，广东广州510055）

胚胎干细胞（ESCs）/诱导多能干细胞（iPSCs）因其有潜在成瘤性，制约了它的临床应用。间充质干细胞（MSCs）具有多向分化能力、免疫调节功能以及低免疫原性，且仍未发现它有成瘤性，因而成为干细胞治疗颇具临床应用价值的种子细胞。近年来研究发现应用合适的诱导方案可以从ESCs/iPSCs获取MSCs，结合ESCs/iPSCs的无限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs转化将可能是获取MSCs的一种数量充足且稳定的新来源。本文将对目前ESCs/iPSCs向MSCs转化的方法、机制以及新衍生的MSCs的免疫调节功能、干性特征做一综述。

胚胎干细胞；诱导多能干细胞；间充质干细胞

胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）拥有无限的自我更新能力以及多胚层分化能力，可以在体外维持足量的细胞储备。由于ESCs存在伦理争论、免疫抑制以及潜在的成瘤性，限制了它在临床上的应用。近年来，来源于成体细胞的iPSCs摆脱了ESCs的伦理困境。同时，它拥有与ESCs相似的胚胎干细胞特性，使得其较ESCs具有更为优越的临床应用前景。然而，其潜在的成瘤风险仍是制约其临床应用的关键。研究表明，MSCs在移植的过程中具有多向分化能力、免疫调节功能以及免疫耐受性[1]。MSCs能够迁移到受损组织处，通过分泌细胞因子、化学因子以及分泌细胞外基质蛋白促进组织损伤修复。且目前仍未有研究发现MSCs具有成瘤性。因此，MSCs是干细胞治疗颇具临床应用价值的种子细胞。MSCs存在于骨髓、脂肪组织、牙髓、滑膜、滑液以及肌肉等身体多处组织器官里。MSCs的获取需选择合适的供体，同时多数操作过程有创，且质和量差异较大。因此，建立一种稳定地、数量充足的MSCs获取来源对于临床应用是必不可少的。

研究报道应用合适的诱导方案可以从ESCs/ iPSCs获取MSCs，ESCs/iPSCs的无限自我更新能力，ESCs/iPSCs向MSCs转化策略将可能是获取临床应用级别MSCs的一种数量充足且稳定的来源。目前，ESCs/iPSCs向MSCs转化的分子机制不明，而且转化方法较多，且转化效率参差不齐，不同方法转化而来的MSCs干细胞特征异质性大。本文将对目前人ESCs/iPSCs向MSCs转化的方法、分子机制以及新衍生的MSCs（ESCs/iPSCs-MSCs）的免疫功能特征，表型、分化潜能等干性特征做一综述。

1 ESCs/iPSCs向MSCs转化的方法

1.1 通过与饲养层细胞共培养的方式实现转化：Trivedi等[2]将ESCs接种于鼠细胞OP9饲养层中共培养8天分离出了MSCs，同时在2周时利用CD34分选可获得造血干细胞。

1.2 通过形成拟胚体再用低密度体外扩增或者分选技术从拟胚体中分离出MSCs：Barbet等[3]先通过36天悬浮培养形成拟胚体，将拟胚体在纤原蛋白元包被板上贴壁培养4周，胰酶消化后，MSCs培养基传代培养于明胶包被板上，从而获得MSCs。Villa-Diaz等[4]将ESCs悬浮培养7天，形成的拟胚体接种于明胶包被板，将贴壁细胞多次传代培养后形成MSCs。Hong等[5]先将ESCs悬浮培养2天形成拟胚体，接种于多孔膜transwell上室，多孔膜允许带有EMT标志和MSCs标志的细胞通过，从而获得均一的MSCs。

1.3 引导ESCs/iPSCs克隆团出现二维自然分化：通过低密度体外扩增或者分选技术从分化细胞中分离出MSCs。Olivier等[6]通过机械分离胚胎干细胞克隆周围分化细胞后，体外传代培养，形成表皮样细胞后，约50～180天再次进行体外传代培养可获得MSCs。Boyd等[7]应用内皮细胞培养基EGM2-MV诱导ESCs分化，20～30天后将形成内皮细胞后体外传代2～3次可获得MSCs。Gruenloh等[8]通过延长ESCs培养基的更换时间诱导ESCs克隆分化，手动挑去可见克隆团，扩增培养分化细胞，多次传代培养后可获得MSCs。Yen等[9]用MSCs培养基诱导ESCs分化增殖，应用胰酶消化传代，可获得MSCs。Wang等[10]先将ESCs定向诱导成为滋养层细胞后，用重组酶TrypLE消化后传代于明胶包被板，可形成MSCs。

1.4 联合细胞外基质和细胞因子诱导单细胞状ESCs/iPSCs发生转化：Lai等[11]用胰酶将ESCs消化成单细胞后，接种于明胶包被板，在MSCs培养基中添加FGF2和PDGF AB或者添加FGF2和EGF，经低密度传代后可获取均一的MSCs。Liu等[12]将ESCs和iPSCs用胰酶打散成单细胞后，接种于I型胶原包被板，用MSCs培养基添加维生素C、地塞米松和ROCK抑制剂Y-27632培养，细胞贴壁后，胰酶消化传代于标准培养板，从而获得MSCs。课题组[13]应用胰酶将ESCs消化成单细胞后，接种于Matrigel包被板，MSCs培养基添加ROCK抑制剂Y-27632培养，胰酶多次消化传代于标准培养板，从而获得MSCs。

1.5 单纯细胞外基质诱导克隆团块状ESCs/iPSCs发生转化：Hynes等[14]先将iPSCs消化机械分离后，接种于明胶包被板，间充质干细胞培养2周，重组酶TrypLE消化，按1：3传代，第2代后，不用明胶包被板，传至5～10代可形成均一MSCs。

1.6 单纯添加细胞因子诱导单细胞状ESCs/iPSCs发生转化：Chen等[15]用拟胚体培养基添加TGF-β抑制剂SB431542诱导ESCs克隆分化，重组酶TrypleSelect消化成单细胞悬液，MSCs培养基传代培养，可获得MSCs。 1.7通过在ESCs/iPSCs中过表达基因实现转化：Liu[16]等发现在ESCs过表达HOXB4，2周后可获得36%CD73+MSCs，经体外传代3次后，可获得均一的MSCs。

2 ESCs/iPSCs向MSCs转化的机制研究

目前，ESCs/iPSCs向MSCs转化的分子调控机制研究十有分有限。近期研究发现通过抑制IκB激酶（IKK）/NF-κB信号通号能抑制ESCs表达胚胎干细胞标志，促进其表达间充质干细胞标志，从而有效地促进人ESCs向MSCs转化。Chen等[15]报道抑制TGFβ/activin/nodal信号通路能促使ESCs向MSCs转化。

3 ESCs/iPSCs-MSCs的免疫调节功能

Wang等[10]研究中ESCs-MSCs能有效抑制T、B淋巴细胞增殖，与骨髓MSCs不同，IFNγ刺激不会上调其表达炎性介质。同时，它还高表达免疫抑制配体PD-L1。研究发现iPSCs-MSCs通过旁分泌迁移抑制因子和生长分化因子-15在蒽环霉素诱导的心肌病中起保护心肌作用。有报道iPSCs-MSCs能维持CD34+造血干细胞的自我更新和增殖能力，同时它能抑制CD4+细胞增殖，在混合淋巴细胞反应中减少促炎因子的分泌，同时增加调节T淋巴细胞的数量。研究发现ESCs-MSCs与BMMSCs相似，能抑制CD4+或者CD8+淋巴细胞增殖，但ESCs-MSCs抑制NK细胞介导的细胞溶解比BMMSCs强；同时它还能抑制NK细胞的毒性效应，下调NK细胞激活受体NKp30和NKp46。

4 小结和展望

ESCs/iPSCs向MSCs转化为临床干细胞治疗提供新的细胞来源。ESCs/iPSCs-MSCs细胞拥有与BMMSCs类似的免疫调节功能以及多向分化能力，同时无成瘤性，使得其在再生医学中十分有前景。由于ESCs/iPSCs向MSCs的分子机制认识十分有限，目前ESCs/iPSCs向MSCs的方法呈多样化且效率差参不齐，ESCs/iPSCs向MSCs的分子机制研究将是未来研究的热点。

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Researching Advances in Embryonic Stem Cell/induced Pluripotent Stem Cell Transforming into Mesenchymal Stem Cells

Sun YangpengZhang Zhiguang
（Guanghua School of Stomatology，Hospital of Stomatology，Sun Yat-sen University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology，Guangzhou 510055，China）

The application of embryonic stem cells（ESCs）/induced pluripotent stem cells（iPSCs）in clinical is limited because of its potential tumorigenicity.Mesenchymal stem cells（MSCs）possess multipotent differentiation capacity，immunoregulatory function and low immunogenicity.Furthermore，no tumorigenicity was observed so far.All the this make MSCs a promising cell source for cell based threapy in clinical application.Recent studies have found that MSCs could be obtained from ESCs/iPSCs through a suitable induction program.In addition，ESCs/iPSCs possess unlimited self-renewal capacity.Therefore，ESCs/iPSCs transforming to MSCs will likely be a promising，stable new cell source for obtaining sufficient MSCs.In This paper，we will present the programs about ESCs/iPSCs transforming to MSCs and the underlying mechanisms that were reported so far，meanwhile，the stemness characteristics and immunoregulatory function of these new MSCs were also reviewed.

Embryonic stem cells；Induced stem cells；Mesenchymal stem cells

R392

A学科分类代码：32011

1001-8131（2017）03-0282-03

2016-10-08