PD-L1/PD-1信号通路在脓毒血症的免疫机制中的研究进展*

李文甜， 涂 计， 杨 闻

1武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究二室，武汉 430200华中科技大学同济医学院附属协和医院 2骨科 3麻醉科，武汉 430022

PD-L1/PD-1信号通路在脓毒血症的免疫机制中的研究进展*

李文甜1， 涂 计2， 杨 闻3△

1武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究二室，武汉 430200华中科技大学同济医学院附属协和医院2骨科3麻醉科，武汉 430022

脓毒血症； 免疫抑制； PD-1； PD-L1； 共刺激因子

脓毒血症是各种微生物和免疫物质引起的全身炎症反应和宿主自身免疫性损伤，是严重创伤、损伤、外科大手术后常见的并发症，是危重患者死亡的主要原因[1-2]。脓毒血症的主要病理生理机制是宿主免疫功能受损导致失去消灭入侵病原体的能力，增加了继发感染的易感性。过去10年间的基础和临床研究已经证实脓毒血症不仅会造成严重的感染，而且会使得适应性的免疫系统障碍和机体抗菌能力受损[3]。越来越多研究表明，免疫功能失调在脓毒血症导致器官功能衰竭的发病过程中起着关键作用[4-5]。近年来，程序性死亡配体-1/程序性死亡受体-1通路(PD-L1/PD-1通路)在脓毒血症引起的免疫负调控机制中的作用日益受到学者的关注[6]。脓毒血症可能与PDL1-PD1共刺激信号随着机体的炎症程度、免疫状态和遗传背景不同而激活或抑制，以及参与T细胞的中枢及外周免疫耐受等机制有关。因此，能否通过PDL1-PD1信号通路来调节自身免疫状态，从而治疗相关疾病，成为人们研究的热点。本综述回顾PD-L1/PD-1信号通路在脓毒血症的免疫机制研究中的进展，以期为脓毒症的预防与治疗提供新的线索。

以前认为严重的感染后炎症反应是脓毒血症患者死亡的主要原因，然而抗炎药物，如抗肿瘤坏死因子-α抗体和可溶性白介素-1抗体，并没有显示出对脓毒症有益的效果[6]。随着医疗技术的进步，通过使用包括机械通气和连续肾脏替代疗法，使得大多数因脓毒血症所致肺衰竭或肾衰竭患者的生存率得以改善。但是目前普遍认为，难以控制的原发性或继发性感染所造成免疫系统失调实则是导致严重脓毒症患者死亡的主要原因。

1 脓毒血症的定义及产生

脓毒血症是美国危重患者死亡的主要原因。在美国每年约有25万例因脓毒血症死亡的病例[7-8]。1991年，北美共识会议将脓毒血症定义为在已知(或强烈怀疑)感染存在下的损伤或感染刺激的宿主免疫应答(全身炎症反应综合征，SIRS)[9]。脓毒血症是指宿主对来自腹部、皮肤、肺或泌尿道的细菌、病毒或真菌感染的免疫应答。脓毒血症被认为是由两个不同阶段组成：促炎阶段和抗炎阶段。通常，促炎阶段首先占优势，其中先天性免疫系统释放细胞因子以动员宿主抵抗感染的能力，同时募集适应性免疫系统的成员以产生强烈的免疫应答。抗炎阶段，称为CARS(代偿性抗炎反应综合征)[10]，通常被定义为机体不能对确定的抗原或感染性攻击作出反应。虽然这些阶段被认为是不同阶段的病理过程，但大多数实验疗法最初主要是针对促炎阶段。这些初始治疗方法仅基于这样的前提：当受到脓毒性或感染性刺激时，产生的高浓度的促炎介质可在实验中或者在临床环境中引起明显的器官损伤，从而产生危重病情。然而，集中在促炎阶段的治疗方法并没有特异性地解决脓毒血症诱导的免疫抑制效应。目前，与传统的针对炎症反应的治疗方法相反，应用细胞因子和共抑制分子拮抗剂改善危重患者的免疫反应成为新的治疗脓毒血症的方法。

2 脓毒血症所导致的免疫抑制

Hotchkiss等[11-12]认为机体对脓毒血症的反应是多个方面的，一些患者在感染初期体内产生了前炎性细胞因子和抗炎细胞因子，另一些患者则仅仅是减少了细胞因子的分泌或者抗感染的免疫应答。虽然很多患者在脓毒血症的早期便不治身亡，然而通过利用针对免疫抑制阶段的治疗方式，却可以挽救大部分的患者[13]。Abraham[14]和Holthoff[15]等通过大量的临床前期研究和临床研究证实多器官衰竭是脓毒血症的普遍归宿。近年来，越来越多的证据表明免疫抑制是脓毒血症所导致患者死亡的主要原因[16-17]。Hotchkiss等[18]通过研究发现免疫抑制是脓毒血症早期重要的病理生理变化，其对脓毒血症患者的预后有着至关重要的影响。由脓毒血症引起的免疫抑制主要表现为以下几个方面：① CD4+Foxp3+调节性T细胞升高[19]；② T细胞功能失调；③T细胞增殖能力下降；④ Th1反应的抑制(IFN-γ分泌减少)[20]。脓毒血症通过提高机体内CD4+CD25+Treg细胞的数量，抑制Th1细胞的增殖并降低炎性因子TNF-α的分泌，增强单核细胞和中性粒细胞的凋亡，同时降低中性粒细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-8。许多研究也发现多种免疫负向调节细胞因子在脓毒症病理过程中发挥着重要作用[21-22]。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子-2热休克蛋白和锌指蛋白A20在炎症组织中呈现高表达状态，在脓毒血症机体内与多种配体结合从而发挥负调控效应，从而影响脓毒血症小鼠的生存。脓毒血症时STAT途径参与机体免疫应答的负反馈调节过程，从而有效地维持机体的免疫自稳状态[23]。Toll样受体介导的信号转导通路通过多水平调节也介导免疫负调控功能。近年来，PD-L1/PD-1通路在脓毒症引起的免疫负调控机制中的作用日益受到学者的关注[24]。脓毒症中淋巴细胞和巨噬细胞表面的PD-1与其配体PD-L1结合后可以抑制T细胞的增殖，促使T细胞发生凋亡或失能，并减少T细胞内细胞因子的分泌，并最终影响脓毒血症小鼠的生存率[20]。

3 PD-L1/PD-1信号通路

PD-1是新近发现的一个免疫细胞抑制性共刺激分子，其配体PD-L1和PD-L2是B7家族成员。PD-L1/PD-1信号途径在保护机体避免自身免疫损伤并维持免疫稳态中有重要意义。其在免疫调节中起着关键性的作用，并在慢性病毒、细菌感染、脓毒血症的发生发展过程中扮演重要角色，近年来受到国内外学者的广泛关注。PD-1属CD28家族成员，是一个55 kD的Ⅰ型跨膜表面受体蛋白，表达于CD4+T细胞、B细胞和单核细胞表面，其最显著的特征是胞质区包含了2个酪氨酸信号结构域。其中ITBS(immunoreptor tyrosine-based switch motif)结构域的第2个酪氨酸磷酸化后，招募酪氨酸磷酸化酶SHP2和SHP1到PD1的胞内区。这些磷酸酶对膜区附近的TCR受体相关信号分子ZAP7θ、PKCθ和CD3ξ去磷酸化，从而抑制TCR/CD28信号传导，在介导免疫负性调节中起关键作用[25]。与其他CD28超家族成员相比，PD-1信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用，与自身免疫病、肿瘤、慢性感染及炎症密切相关。PD-1的反应配体有2种：PD-L1和PD-L2。Fife等[26]发现PD-L1表达则非常广泛，T/B细胞、DC细胞、血管内皮细胞、多种间质细胞、肝细胞、胰岛细胞、神经胶质细胞、胎盘组织均可被诱导表达PD-L1，提示PD-1/PD-L1信号通路在机体内发挥广泛的作用。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原递呈细胞上，如活化的巨噬细胞和DC[27]。

4 PD-L1/PD-1通路在脓毒血症所导致的免疫抑制中的作用

为了研究PD-L1/PD-1途径对淋巴细胞及单核细胞的作用，Patil等[3]通过实验对PD-L1/PD-1途径在体外进行阻断，研究T细胞凋亡及单核细胞功能的变化。实验结果显示用抗PD-L1抗体阻断PD-L1/PD-1途径后能够在TNF-α、TCR两条凋亡途径中降低T淋巴细胞的凋亡率。同时，阻断PD-L1/PD-1途径后还能够提高单核细胞的功能，使细胞在LPS刺激后分泌细胞促炎因子的水平增加，抗炎因子的水平降低。Zhang[28]和Chang等[29]发现对患有脓毒血症的小鼠使用抗PD-1或PD-L1抗体来阻止淋巴细胞耗竭和转化，可增强小鼠的细菌清除率。Dai等[30]通过研究表明了PD-L1/PD-1信号通路的具体的机制：PD-L1/PD-1结合通常导致基于PD-1内部免疫受体酪氨酸的抑制(ITIM)或开关基序(ITSM)结构域的酪氨酸磷酸化，导致磷酸酶的募集，例如Src同源区域2结构域磷酸酶SHP-1/SHP-2，使TCR-CD3分子和下游的ZAP70发生去磷酸化；此外，通过阻断细胞抗凋亡因子Bcl-XL的表达，进一步阻断PI3K的活化，下调IL-2表达和葡萄糖代谢。而IL-2的表达下调又进一步诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞处于功能失活状态，导致抑制信号的T细胞和负调节激活，起到免疫负调控作用。与之相似，PD-Ls与B细胞上的PD-1结合后，PD-1胞质区ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，募集SHP-2磷酸酶，使信号分子Igα/β和Syk发生去磷酸化，进一步减弱下游分子PLCγ2，PI3K，vav，以及ERK1/2的活化，从而传递免疫抑制信号。

由于在病毒感染和癌症中，CD4+和CD8+T细胞上的PD-1的表达是上调的，因此我们通常认为PD-1的表达与“T细胞衰竭”现象相关，并认为这是T细胞持续与病毒抗原或肿瘤细胞接触的结果[31-32]。抗PD-1和抗PD-L1抗体治疗在针对癌症的临床试验中显示出显著的效果，我们可以认为它们在脓毒血症患者中也可能具有类似的有益效果。FDA最近已经批准了PD-1单克隆抗体用来治疗癌症，这极大地鼓舞了脓毒血症的治疗领域，因为据观察脓毒血症和癌症在免疫缺陷方面有很多的相似之处，并且治疗癌症的相关药物也能够提高脓毒血症小鼠模型的存活率[12，33-36]。

在脓毒血症期间，因为存在广泛的白细胞凋亡，免疫抑制以免疫细胞失活的形式为主。PD-1及其配体和其它共抑制细胞表面家族成员已被认为是“T细胞失能”的标志物。Laudanski等[37]通过对人淋巴细胞群研究分析显示，严重创伤后的人体，在淋巴和骨髓细胞谱系的各种成分上的共抑制受体表达增加，这一研究结果将会鼓励我们对PD-1和其它共抑制剂细胞表面家族成员在脓毒血症中所起的作用做进一步研究。在脓毒血症的动物模型中，PD-1表达缺陷的小鼠能够免于脓毒血症引起的死亡[38]。当这些PD-1表达缺陷的动物感染脓毒血症时显示细菌负荷减少，抗菌和抗感染反应增加。这项研究认为在脓毒血症感染中，单核/巨噬细胞和淋巴细胞上的PD-1表达有助于免疫反应的抑制。当用抗PD-1中和抗体处理脓毒症动物时，发现类似的结果[39]。另一项使用PD-L1阻断抗体的研究显示脓毒症动物的存活率提高，淋巴细胞凋亡减少[28]。重要的是，据报道，在脓毒性休克和创伤患者的单核细胞和T淋巴细胞群上具有增加的PD-1和PD-L1水平[24，27]，这再次表明PD-1和其他共抑制细胞表面分子不仅是免疫抑制的潜在指示剂，而且也是潜在的治疗靶点。

另外，在讨论T细胞耗竭的细节时，我们可以发现在脓毒血症中，抑制性受体的表达，例如T细胞表面的PD-1以及在抗原提呈细胞和实质性细胞表面PD-L1，这些受体的表达抑制了T细胞的功能。抗PD-1抗体已经在治疗感染性疾病的过程中显示出巨大的成功。越来越多科研人员发现在脓毒血症的各种病理模型中PD-L1/PD-1通路的阻断剂能够有效地恢复T细胞效应器的功能，增加IFN-γ的分泌量，防止细胞的凋亡并且提高患者的存活率[28-29，38-40]。

这些方面综合说明在脓毒血症过程中，PD-1可能不仅仅是一个单核-巨噬细胞功能障碍的标志，还有可能成为一个治疗的靶点，通过它来调节初始免疫反应引起的强烈的机体炎症反应，以改善脓毒血症预后。

5 总结和展望

对于脓毒血症患者，抗PD-1和抗PD-L1抗体能够改善关键免疫缺陷，逆转T细胞耗竭。这2种抗体起着同样有效的作用。因此，结合在临床和实验研究中发现的其他细胞标记以及淋巴细胞PD-1的表达，可能有助于识别脓毒血症患者。目前的研究结果表明，T细胞耗竭导致免疫功能紊乱是脓毒血症病情进展的主要原因，通过利用抗PD-1和抗PD-L1抗体逆转T细胞的耗竭，将有望为这种高致命性疾病的治疗带来新的希望。

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(2016-09-05 收稿)

*国家自然科学基金青年基金资助项目(No.8140080767)

R392.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.025

李文甜，女，1992年生，硕士研究生，E-mail：lwttangtang@outlook.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：yangwenaya@hotmail.com