一株产胞外多糖土壤细菌培养条件的优化

尚天翠， 卫 刚， 赵 玉

(1. 伊犁师范学院 生物与地理科学学院，伊宁 835000； 2. 新疆伊宁卫生学校 专业基础学科，伊宁 835000)

一株产胞外多糖土壤细菌培养条件的优化

尚天翠1， 卫 刚2， 赵 玉1

(1. 伊犁师范学院 生物与地理科学学院，伊宁 835000； 2. 新疆伊宁卫生学校 专业基础学科，伊宁 835000)

对从新疆伊犁霍城县大西沟野生樱桃李林分离筛选的一株具有产胞外多糖能力的土壤细菌L20309的发酵条件进行了初步研究。结果表明，土壤细菌L20309 产胞外多糖的最佳碳源、氮源分别为葡萄糖和蛋白胨，碳氮源最佳质量浓度分别为20 g/L和30 g/L；最佳培养条件为:培养基初始pH 7.0，培养基装量500 mL/L，接种量5%，培养温度28℃。在此条件下培养72 h，土壤细菌L20309产胞外多糖2.562 μg/mL。

土壤细菌；胞外多糖；培养基优化；发酵

微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)不仅是微生物适应所在环境的代谢产物，而且是具有自我保护的一类长链化合物[1-2]。因具有容易分离，性质稳定等生物学特点，在医药、食品等多个行业具有潜在的发展前景[3-6]，已成为人们研究的热点之一。所以，研究和开发微生物产胞外多糖的性能具有广阔的商业价值。但是营养物质(碳源、氮源)和发酵培养条件(温度、pH值、装液量等)影响微生物产胞外多糖，从而影响了细菌的生长速率和胞外多糖的积累[7]。张熹等[8]的研究结果表明，影响胞外多糖产糖效果的最适碳源和氮源分别是葡萄糖和硫酸铵。张晓玲等[9]研究了枯草芽孢杆菌胞外多糖产生的发酵培养条件，最终得到了高纯度的多糖，为提取高产量的胞外多糖提供了理论依据。因此，目前的首要工作是优化微生物胞外多糖的培养条件。本文通过L9(34)正交试验优化了土壤细菌L20309产胞外多糖的培养条件，旨在为发酵工艺提供实验指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤细菌L20309，由新疆伊犁霍城县的大西沟分离纯化得到，保藏在伊犁师范学院微生物实验室。

牛肉膏蛋白胨培养基(ABA)：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂粉16～20 g、蒸馏水1L、pH 7.2～7.4。

牛肉膏蛋白胨培养基+土壤浸提液：葡萄糖 1 g、 蒸馏水800 mL、牛肉膏3.0 g、K2HPO40.5 g、CaCO30.5 g、蛋白胨5.0 g、土壤浸提液200 mL、琼脂 16～20 g、pH 7.2～7.4 。

LB培养基(种子培养基)：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1L、pH 7.0～7.2。

发酵培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、MgSO40.05%、Na2HPO40.2%、NaH2PO40.1%、pH 7.0。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；HSP-250恒温恒湿培养箱(金坛市鑫鑫实验仪器有限公司)；HH.S21-8数显恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BS-1E智能型振荡培养箱(金坛市正基仪器有限公司)；UV2600PC紫外、可见分光光度计(上海舜宇恒平科学有限仪器公司)；QYC-200全温培养摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司)；TB-214电子天平(北京丹佛仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 发酵方法[10]

将菌株活化后接种到装有种子培养基的三角瓶中，28℃，160 r/min振荡培养18 h。然后每瓶以5%的接种量将种子培养液接种到装有发酵培养液的三角瓶中, 28℃，160 r/min振荡培养 40 h。

1.3.2 分离多糖[10]

取适量发酵液于8000 r/min、离心15 min，取上清液10 mL，加入3倍体积的95%乙醇在4℃冰箱沉淀过夜。再次离心后将沉淀用蒸馏水定容到10 mL，采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖。

1.3.3 多糖发酵单因素试验

为提高产糖效率，通过设计单因素实验，恒温培养40 h，测定产糖量，选择营养及发酵因子中的最佳水平，如表 1 。

表 1 单因素试验的因子与水平Table1 Factors and levels for single factor test

1.3.4 4因素3水平正交试验

在单因素试验结果的基础上，设计4因素3水平正交试验，确定最优的培养基组合，如表2。

表2 正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 培养基成分的确定

2.1.1 最适碳源

土壤细菌L20309经活化培养后，以5%的接种量接入到碳源分别为可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖的发酵培养基中， 28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图1)。从图1中可以看出，菌株对这6种碳源均可以利用，但葡萄糖作为发酵培养基的碳源效果最佳，其产糖量达到了1.440 59 μg/mL，蔗糖次之，果糖和乳糖利用率最低。因此，葡萄糖是产胞外多糖效果最好的碳源。

图1 碳源对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 1 Effects of carbon sources on soil bacterium L20309 EPS production

2.1.2 最适碳源浓度

碳源只有在较适合浓度时，才能促进菌株的生长，并产生代谢产物。确定最佳碳源的种类为葡萄糖后，还需考察其最佳质量浓度，才能更高效地进行发酵。按照以上同样的培养条件，将碳源质量浓度分别设置为5、10、15、20、25、30和35 g/L，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图2)。由图2可知，当碳源浓度为20 g/L时，产胞外多糖最高。因此，20 g/L是产胞外多糖效果最好的碳源浓度。

2.1.3 最适氮源

氮源也是细菌生长所需要的一种重要物质。按照以上的培养条件，发酵培养基以20 g/L葡萄糖为碳源，分别以蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵为氮源，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图3)。从图3可见，以蛋白胨作为发酵培养基的氮源时，土壤细菌L20309的产糖量最大，产糖量达到1.24568 μg/mL。因此，蛋白胨是产胞外多糖效果最好的氮源。

图2 碳源质量浓度对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 2 Effects of sucrose concentrations on soil bacterium L20309 EPS production

图3 氮源对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 3 Effects of nitrogen sources on soil bacterium L20309 EPS production

2.1.4 最适氮源浓度

氮源浓度也是影响细菌产胞外多糖的关键因素。按照以上的发酵培养条件，分别设置蛋白胨浓度为5、10、15、20、25、30和35 g/L，28℃，160 r/min振荡培养40 h，测定胞外多糖产量(图4)。由图4可知，产糖效果最好的是30 g/L的蛋白胨浓度。因此，土壤细菌L20309发酵培养基的氮源浓度选择30 g/L最好。

图4 氮源质量浓度对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 4 Effects of nitrogen concentrations on soil bacterium L20309 EPS production

2.2 影响土壤细菌L20309产胞外多糖效果的培养条件

2.2.1 最适温度

在碳源、氮源质量浓度分别为20和30 g/L的条件下，温度分别设为18、23、28、33和38℃，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图5)。由图5可知，当温度为28℃时产糖量最大，产糖量为1.509 94 μg/mL，温度高于28℃后细菌产糖量下降。因此，选择28℃为最佳发酵温度。

图5 温度对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 5 The effect of temperature on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.2 最适pH值

在其他条件不变，确定发酵培养基的培养温度为28℃的条件下，分别以4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0为初始pH值，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图6)。从图6可见，土壤细菌L20309在6.0～8.0的pH值范围内生长较好，当pH值为7.0时产糖量最大，产糖量为1.68003 μg/mL。因此，选择7.0为最佳初始pH值。

2.2.3 选择最适装液量

在其他条件不变，确定发酵培养基的pH 7.0的条件下，设置装液量为20、30、40、50、60和70 mL的发酵培养基(150 mL摇瓶)，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量(图7)。由图7可以看出，产胞外多糖最好的装液量为50 mL(150 mL摇瓶)时。因此，选择装液量50 mL(150 mL摇瓶)为最好。

图6培养基初始pH对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 6 The effect of culture medium initial pH value on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.4 选择最适接种量

以同样的条件，装液量为50 mL(150 mL摇瓶)，分别接入 2%、5%、8%、11%和14%的接种量，28℃，160 r/min振荡培养 40 h，测定胞外多糖产量，结果见图8。由图8可知，产糖效果最好的接种量是5%。因此，选择5%为最佳接种量。

图7 培养基装量对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 7 Effects of culture medium volumes on soil bacterium L20309 EPS production

图8 接种量对土壤细菌L20309多糖产量的影响Fig 8 The effect of inoculation quantity on soil bacterium L20309 EPS production

2.2.5 培养条件的正交试验

以单因素实验设计为基础，确定土壤细菌L20309发酵培养的影响条件，设计4个因素3个水平，采用 L9(34)进行正交试验，结果如表3。

由表3可以看出，影响土壤细菌L20309产胞外多糖效果最好的发酵条件为：A2B2C3D2，即培养基初始pH7.0，培养温度28℃，接种量5%，培养基装量50 mL(150 mL摇瓶)。由表3方差分析可以看出， 影响胞外多糖产量效果最好的因素大小顺序为：B>D>C>A，也就是培养基初始pH值>接种量>培养基装量>培养温度。因此，当碳源、氮源确定的情况下，初始pH值是影响土壤细菌L20309产胞外多糖的主要因素。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

2.3 发酵曲线分析

上述实验已经探究出了该细菌的最佳培养条件：温度28℃、pH 7.0、装液量500 mL/L、接种量5%。以最佳培养条件下每隔12 h测定发酵液多糖产量和菌量(D600 nm)，结果见图9。

图9 土壤细菌L20309生长和产胞外多糖Fig 9 The growth of soil bacterium L20309 and producing exopolysaccharides

由图9可知，12～72 h为细菌的快速生长期，72 h细菌生长量达到了最大，同时产糖量也达到了最大，产糖量为1.732 50 μg/mL，之后细菌进入衰退期，生长量和产糖量都在逐渐减小。因此，该菌发酵产糖效果最好的培养时间是72 h。

3 讨论与结论

研究报道，微生物的营养成分、培养条件等在一定程度上影响着胞外多糖的结构、生理功能以及胞外多糖产量[11-13]。本研究也表明发酵培养基利用不同的碳源发酵，最终影响细菌的产糖效果，这与刘天华等[14]的研究结果一致。不仅如此，添加不同的氮源，胞外多糖产量也表现出较大的变化[15]。本研究以蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、牛肉膏，硫酸铵、氯化铵为氮源时，发现氮源为蛋白胨时，土壤细菌L20309的产糖量最大。因此该菌株产胞外多糖最理想的碳源是葡萄糖，浓度为20 g/L，氮源为蛋白胨，浓度为30 g/L。

本研究在碳源为20 g/L葡萄糖，氮源为30 g/L蛋白胨确定的情况下，设计4个因素3个水平的正交试验，对影响产胞外多糖的因素进行了评价，继而确定了L20309产胞外多糖最优培养条件：温度28 ℃、pH 7.0、装液量50 mL(150 mL摇瓶)、接种量5%。从培养条件优化的主次因素来看，初始pH值是影响土壤细菌L20309产胞外多糖的主要因素，初始pH 6.0～8.0的范围内产糖较好，低于或高于这个范围产糖效果都会明显下降；接种量控制在5%适宜，低于5%影响产糖效果，耗时耗力，高于5%浪费菌种；装液量不足或过多都会影响菌体产糖的积累[16]，装液量为50 mL(150 mL摇瓶)适宜；温度是影响微生物生长的因素之一，因此在发酵过程中要控制好温度，过高或过低都会影响微生物的发酵程度，较适宜的发酵温度是23℃～33℃。

利用最优培养条件对土壤细菌L20309进行了摇培发酵，从细菌的生长曲线和产糖结果来看，在培养12～72 h内，细菌的生长量和产糖量都在增加，72 h菌量及产糖量达到最大，72 h之后逐渐衰退，因此发酵时间选择72 h适宜，表明稳定期是产糖积累的最佳时期。实验结果表明本研究分离的一株土壤细菌L20309具有产糖能力，可以为今后的微生物工业领域提供相关的实验指导。

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The optimizition of exopolysacchrides production by an soil bacterium

SHANG Tian-cui1, WEI Gang2, ZHAO Yu1

(1. School of Biology and Geography Science, Yili Normal University， Yining 835000;2. The Professional Foundation Course, Yining Health School, Yining 835000, China)

The soil bacterium L20309 with production capacity of extracellular polysaccharide was isolated from theprunusdivaricatain Daxigou of Xinjiang and the fermentation conditions were optimized. Results showed that the better carbon and nitrogen sources for it to produce extracellular polysaccharide were glucose and peptone, and the optimal mass concentrations of carbon and nitrogen sources were 20 g/L and 30 g/L, respectively. The optimal growth conditions were pH 8.0 of the medium, the loading sample of 500 mL/L, the inoculum of 5% of 28℃. When cultured under such condition for 72 h, the polysaccharide product could reach to 2.562 μg/mL.

soil bacterium; extracellular polysaccharide; medium composition; fermentation

2016-04-20；

2016-06-02

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2015211C294)

尚天翠，硕士，高级实验师，研究方向为植物与微生物资源利用,E-mail：shang2000_1@163.com

Q936;TQ920.6

B

2095-1736(2017)01-0103-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.103