拮抗软腐病菌的魔芋内生细菌多样性研究

林天兴+龚明福+管芩澜

摘要：生活在魔芋组织中的内生细菌具有拮抗魔芋软腐病病菌的潜力。通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌，用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用，使用肠杆菌重复居间序列聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法研究其遗传多样性。结果表明，从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌，35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性，ERIC-PCR指纹图谱显示35株内生细菌在Watson距离为0.60时可分为4个ERIC群和4株独立成群菌株，表明35株拮抗性内生细菌的遗传多样性明显。

关键词：魔芋；内生细菌；胡萝卜软腐欧文氏菌；多样性

中图分类号： S182文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0197-02

魔芋（Amorphaphallus konjac）是天南星科魔芋属单子叶多年生草本植物。魔芋块茎中葡甘聚糖（KGM）含量非常丰富，已被应用于食品、医药、化工行业和农业，因此魔芋在中国有广泛的栽培。魔芋软腐病是魔芋的主要病害，已经严重影响到魔芋的生产，是魔芋产业发展的重要障碍。该病是由胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，简称Ecc）引起的细菌性病害[1]，除了魔芋，Ecc还可能导致花椰菜、番茄、辣椒、白菜、萝卜、豆科植物及其他植物的软腐病。

芽孢杆菌在自然界存在非常普遍，可以生产各种抗菌物质，抑制植物病原菌[2]，有许多利用芽孢杆菌来生物防治魔芋软腐病的例子[3-7]。笔者课题组近年来从四川省夹江县、峨眉山和沐川县魔芋块茎中分离得到35株内生细菌，对内生细菌拮抗魔芋软腐病菌的能力进行了测定，使用总DNA序列肠杆菌重复居间序列聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法，研究了35株魔芋拮抗性内生细菌的遗传多样性，为魔芋软腐病的生物防治提供菌株资源。

1材料与方法

1.1魔芋内生细菌的分离

从四川省夹江县、峨眉山、沐川县的魔芋种植区中采集150个魔芋的球茎，每个球茎表面用0.1% HgCl2消毒，漂洗后用灭菌蒸馏水清洗5次。表面消毒的球茎用无菌粉碎机粉碎，取汁液划线于营养琼脂培养基（NA，包括牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂15.0 g/L）平板上，28 ℃ 恒温培养3 d后对单个菌落进一步纯化，多次重复上述操作，得到的纯菌落接种到试管斜面中保存备用。最后1次球茎表面消毒的水接种在NA培养基上，并在28 ℃恒温培养箱中培养72 d来彻底检查表面消毒是否彻底。

1.2抑制魔芋软腐病菌的拮抗菌筛选

在NA板涂布接种0.1 mL软腐病菌培养液（109～1010 CFU/mL）。取4个规格相同的灭菌牛津杯（内径6 mm、外径8 mm）均匀插入NA板之间并保证牛津杯不能接触到NA平板的底部。分装100 μL测试供试内生菌菌液于3个牛津杯中。最后1个牛津杯中装入100 μL的灭菌的菌液作为对照组，每处理重复3次，28 ℃下培养48 h后测量抑菌圈的大小。内生细菌对病原细菌的拮抗活性用菌落抑制大小（colony inhibited size，CIS）表示，CIS=供试菌株抑菌圈-牛津杯外径。

1.3拮抗性内生细菌ERIC-PCR指纹图谱分析

拮抗性内生细菌总基因组DNA提取参考徐琳等的方法[8]。特异性引物选择ERIC1R和ERIC2L[9]，由上海香农生物工程技术服务有限公司合成。反应体系为25 μL，其成分是10×缓冲区（Biorule）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）2.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，ERIC1R（20 pmol/μL）0.5 μL，ERIC2L（20 pmol/μL）0.5 μL，添加13 μL ddH2O，增加总DNA模板（40～80 ng）4.0 μL。ERIC-PCR反应过程参考马溪平等描述的方法[10]。反应结束采用1%琼脂糖凝胶电泳 3.5 h，凝胶成像，图像扫描至计算机保存图谱，在有条带的位置记为“1”，没有的记为“0”。采用DPS软件，根据组平均连锁聚类法（UPGMA）树形聚类图进行0-1的聚类分析[11]。

2结果与分析

2.1魔芋内生细菌的分离

从健康魔芋球茎中分离得到35株内生细菌，其中10株采自夹江县（菌株编号为AKEB01至AKEB10），15株采自峨眉山（菌株编号为 AKEB11至AKEB25）及10株采自沐川县（菌株编号为AKEB25至AKEB35）。

2.2抑制魔芋软腐病菌的拮抗菌筛选

从魔芋中分离得到的35株内生细菌对魔芋软腐病菌均具有不同程度的拮抗活性（表1），不同菌株的拮抗活性有显著差异，7株拮抗性内生细菌（AKEB06、AKEB16、AKEB20、AKEB23、AKEB28、AKEB32、AKEB35）的拮抗活性较强，平均抗菌距离超过15.0 mm，其中AKEB06拮抗活性最强，平均抗菌距离19.3 mm。

3结论

从健康魔芋球茎中分离得到35株内生细菌菌株，这些内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性，其中7株抗菌距离超过15.00 mm。ERIC-PCR分析表明，当Watson距离0.60时，35株拮抗性内生细菌菌株可分為4个ERIC群和4个独立成群的菌株，当Watson距离为1.00时所有测试菌株聚集在一起。研究结果表明拮抗性内生细菌存在遗传多样性。

目前，拮抗细菌性病原的物质大多基于体外抗菌法从草药及其提取物中筛选获得，从魔芋中分离得到的内生细菌菌株表现出较好的拮抗活性，并且多样性明显，因此，从魔芋内生细菌中筛选具有软腐病抗性的内生细菌菌株资源非常丰富。

参考文献：

[1]Toth I K，Bell K S，Holeva M C，et al. Soft rot erwiniae：from genes to genomes[J]. Molecular plant pathology，2003，4（1）：17-30.

[2]Tamehiro N，Okamoto-Hosoya Y，Okamoto S，et al. Bacilysocin，a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，46（2）：315-320.