肉桂醛及其衍生物对木材腐朽菌和霉菌的抑制作用

杨冬梅，王慧，李淑君*，袁海舰,2

(1.东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室,哈尔滨150040；2.黑龙江省国土资源厅，哈尔滨150090)

肉桂醛及其衍生物对木材腐朽菌和霉菌的抑制作用

杨冬梅1，王慧1，李淑君1*，袁海舰1,2

(1.东北林业大学生物质材料科学与技术教育部重点实验室,哈尔滨150040；2.黑龙江省国土资源厅，哈尔滨150090)

天然存在的肉桂醛具有广谱的抗菌生物活性。为了开发环保、高效的木材防腐防霉剂，通过滤纸片法和处理材室内防腐防霉试验考察了肉桂醛及其3种衍生物对木材的防腐和防霉作用。滤纸片法实验结果表明，肉桂醛对4种供试菌种(即：密粘褶菌、彩绒革盖菌、黑曲霉和桔青霉)均表现出最强的抑菌性能。然而，在密粘褶菌对木材的腐朽试验中，对氯肉桂醛表现出最好的保护性能，在浓度为40 g/L时即达到Ⅰ级耐腐；肉桂酸表现出优于肉桂醛的保护能力，在浓度为10 g/L时即达到Ⅱ级耐腐，而肉桂醛在20 g/L时方可达到Ⅱ级耐腐。在彩绒革盖菌对木材的腐朽试验中，肉桂醛和肉桂酸在浓度为50 g/L时达到Ⅰ级耐腐。在防霉方面，肉桂醛与对氯肉桂醛对黑曲霉和桔青霉有最好的防霉效果，特别是对于桔青霉，在浓度为68.67 g/L时完全防止了桔青霉的霉变。对于黑曲霉，在同样浓度下，两种化合物处理的木材试样都只是发生了很少的霉变。肉桂醛及其衍生物表现出对木材很好的保护作用，且环境友好，可广泛应用。

肉桂醛；肉桂醛衍生物；抑菌；木材腐朽菌；霉菌

大多数植物为了维持自身的生长代谢或者发展对病原体的攻击能力，自身会产生抗菌的次生代谢物，这些植物自身产生的抗菌剂可以用作天然防腐剂[1-2]。肉桂醛(cinnamaldehyde，cinnamic aldehyde)主要存在于肉桂油、桂皮油、玫瑰油、藿香油、风信子油中，是醛类化合物，为黄色液体，是中国传统中药肉桂油的主要活性成分(含量60%～75%)[3]。

肉桂醛具有非常广泛的抗菌生物活性，对肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)[4]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[5-6]、大肠杆菌(Escherichiacoli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimu-rium)[7]、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)[8]、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)和脆弱类拟杆菌(Bacteroidesfragilis)有很强的抑制作用，对人类粪便中的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)具有适度的抑制作用[9]。肉桂醛作为食品调味剂在食品和药物管理局(FDA)是经过注册的，允许被添加到食品中，常用作食品防腐剂[10-11]。李红良等[12]研究肉桂醛防腐剂对麻辣素食具有很好的防腐保鲜效果，可以达到山梨酸钾和丙酸钙防腐效果的5～20 倍。张彬等[13]认为大豆蛋白分离可食膜中添加6%的肉桂醛可大幅提高鲜猪肉的保鲜效果。肉桂醛对纳米脂质体覆盖的玻璃表面显示出良好的抗菌活性[14]。另据报道，肉桂醛可抑制酿酒酵母细胞壁体外合成酶，可发展抗真菌的有效药物[15]。肉桂醛之所以具有抑菌、杀菌作用，主要是因为肉桂醛分子中存在一个与苯环形成共轭的醛基。醛基是亲核基团，很容易被细菌表面的亲水基吸附，进而穿过细胞壁，破坏细胞壁中的多糖结构，起到抑菌或杀菌的效果。由于哺乳动物没有细胞壁，所以肉桂醛对人类和动物的细胞是没有破坏作用的[16]。

本研究利用肉桂醛的强抑菌性和使用安全性，考察肉桂醛以及3种肉桂醛衍生物对木材腐朽菌和霉菌的抑菌性能，评价其作为木材防腐防霉剂的可能性，为开发具有环保、高效的木材防腐防霉剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

肉桂油(工业级，江西省吉安市振兴香料油提炼厂)、肉桂酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、对氯肉桂醛(工业级，武汉远成科技发展有限公司)和N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺(实验室自制)[17]。

1.2 试验方法

1.2.1 采用滤纸片法测定肉桂醛类化合物的抑菌性能

供试菌为2种木材真菌彩绒革盖菌(Trametesversicolor)和密粘褶菌(Gloeophylluntrabeum)，2种霉菌黑曲霉(Aspergillusniger)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)。

菌悬液的制备：取生理盐水20 mL和几粒玻璃珠置于小三角瓶中，用棉塞塞好后于121℃高压灭菌30 min，冷却备用。

白腐菌、褐腐菌：将生理盐水倒入已重新接种的菌种试管中，用已灭菌的接种针轻轻刮取表面的菌丝移入小三角瓶中，摇动小三角瓶10 min，使菌丝均匀分散开。

霉菌：将生理盐水倒入已重新接种的霉菌试管中，用已灭菌的接种针轻轻划取表面的孢子，将孢子悬液移入小三角瓶，摇动小三角瓶使孢子完全分散。孢子悬液经5 000 r/min离心分离菌丝后，在显微镜(400倍)下观察，血球计数板计数，经稀释后使孢子浓度在1×106个/mL。

抑菌方法如下：将制备好的PDA培养基、直径8 mm的滤纸片、质量分数0.9%的生理盐水和培养皿均采用高温高压灭菌30～35 min备用。将肉桂醛及衍生物配制成0.25 mol/L的溶液备用。将实验用到的器皿及工具先进行紫外表面灭菌20 min，然后用酒精棉擦干净手及其无菌操作台的桌面。加热已经灭菌的培养基至溶解备用。在灭菌的培养皿中倒入 1 mL的菌悬液和9 mL的培养基，冷却备用，将灭菌后直径为8 mm的无菌滤纸片浸泡在配制好的一定浓度的药液中，干燥后，将滤纸片放入已凝固备用的培养皿中间位置，将培养皿放入恒温培养箱中在28℃下培养3 d，测量滤纸片周围抑菌圈直径。每种药液制备3个平行培养皿，通过对比各抑菌圈大小来反映每种化合物的抑菌作用的强弱。

1.2.2 肉桂醛类化合物对木材的防腐作用

按照中华人民共和国林业行业标准LY/T 1283—2011《木材防腐剂对腐朽菌毒性实验室试验方法》进行。试验所用饲木和试材均为大青杨的边材，尺寸分别为22 mm×22 mm×3 mm、20 mm×20 mm×10 mm(顺纹方向)。试样的恒定质量测试均按标准中的方法在40℃下进行。菌种：彩绒革盖菌(Trametesversicolor)、密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)。防腐剂的质量浓度分别为肉桂醛：5，20，30，40和50 g/L；肉桂酸：5，10，30，50和70 g/L；对氯肉桂醛：5，20，40，50和60 g/L；N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺：5，20，50，70和90 g/L。由于这4种肉桂醛类化合物水溶性均较差，而醇溶性较好，因此以上溶液均用乙醇作溶剂。

通过质量损失率，可以初步评价试材受腐朽菌侵害的程度。不同质量损失率对应的耐腐等级。由于使用的阔叶材作为防腐试材，所以质量损失率在0～10%内为Ⅰ级耐腐，在11%～30%内为Ⅱ级耐腐，在31%～50%内为Ⅲ级耐腐，大于50%为Ⅳ级耐腐。

试样中防腐剂载药量(R)按以下公式计算：

式中：R为试样中防腐剂的保持量，kg/m3；V为试样体积，cm3；c为防腐剂溶液质量浓度，g/L；T2为试样经防腐剂处理后的质量，g；T1为试样经防腐剂处理前的恒定质量，g。

试验结束后，将试样从培养瓶中取出，小心清除试样表面菌丝和杂质，放入烘箱中40℃下烘干至恒定质量，称量(准确至0.01g)，得试样腐朽后质量(T4)。

试样腐朽后质量损失率(L)按以下公式计算：

式中：T3为试样腐朽前恒定质量，g；T4为试样腐朽后恒定质量，g。

1.2.3 肉桂醛类化合物对木材的防霉作用

试验所用试材取自大青杨的边材，尺寸为50mm×30mm×10mm(顺纹方向)，菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)和桔青霉(Penicillium citrinum)。

木块的药液处理：防霉剂浓度为3个梯度浓度，16.13，32.79和68.67g/L，以上药剂均用无水乙醇作溶剂进行配制；空白试样为无菌水和无水乙醇。每一个浓度用 6块试样，分3组平行，每个平行2块试样，采用冷浸法浸泡木块。将同一组试样放在烧杯中井字形堆放，重物压顶，防止浮动，倒入药液，液面高出材堆顶面 2cm，浸渍1min后取出，擦掉表面流动的水分。将经药液冷浸处理后的试样放入灭菌好的培养皿中，盖好培养皿，在超净工作台上放置6h，待用。

试样接菌与培养：在一个培养皿中放同样直径大小的2张滤纸，加入5mL蒸馏水，然后放上2块塑料筛网(以免木块直接接触到湿润的滤纸)，在蒸汽灭菌锅内 121℃、0.1MPa的条件下灭菌 30min；将药液处理后的木块放入培养皿中，将霉菌悬浮液喷洒在木块上两次，上下底面各一次，培养约12h以后，将培养皿用蜡膜封上，防止水分蒸干，然后放在培养箱中培养14d后观察现象。根据霉菌生长的数量评价防霉等级。方法参照文献[18]中的防霉方法。

2 结果与分析

2.1 肉桂醛及其衍生物对腐朽菌和霉菌的抑菌效果

采用滤纸片法测定对肉桂醛及其3种衍生物对腐朽菌和霉菌的抑菌性能，结果见表1。由表1可知，肉桂醛对腐朽菌和霉菌都表现出很强的抑菌效果，抑菌圈直径均大于它的3种衍生物。其次是N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺对腐朽菌的抑菌直径大于肉桂酸和对氯肉桂醛，对霉菌的抑制效果较弱。

表1 肉桂醛及其3种衍生物对腐朽菌和霉菌的抑菌直径

Table 1 Inhibition zone diameter of cinnamaldehyde and three derivatives against decay and mould fungi /mm

2.2 肉桂醛类化合物处理材的防腐效果

处理材对密粘褶菌和彩绒革盖菌的耐腐效果见图1。由图1可知，4种肉桂醛类化合物处理材对密粘褶菌和彩绒革盖菌均有较好的防腐能力，随着药液浓度的增加，试样质量损失率降低。

A.肉桂醛；B.肉桂酸；C.对氯肉桂醛；D.N,N′-二反式对氯肉桂醛-1, 2-乙二胺图1 肉桂醛及其衍生物处理材对密粘褶菌和彩绒革盖菌的防腐效果Fig. 1 Mass loss of wood treated with cinnanmaldehyde and its derivatives against Trametes versicolor and Gloeophyllum trabeum

对密粘褶菌的防腐结果可知，对氯肉桂醛处理材表现出良好的耐腐性能，在浓度为40 g/L时即达到Ⅰ级耐腐。肉桂酸处理材和肉桂醛处理材达到Ⅰ级耐腐的药剂浓度均为50 g/L。肉桂酸在浓度为10 g/L时即达到Ⅱ级耐腐，而肉桂醛在20 g/L时方可达到Ⅱ级耐腐。因此，肉桂酸处理材的耐腐效果稍强于肉桂醛处理材。N,N′-二反式对氯肉桂醛-1, 2-乙二胺处理材的耐腐效果最弱，在浓度为90 g/L时方可达到Ⅰ级耐腐。

对彩绒革盖菌的防腐结果可知，肉桂酸在浓度为10 g/L时达到Ⅱ级耐腐，当浓度达到50 g/L以上时达到Ⅰ级耐腐；肉桂醛在浓度为20 g/L以上时，对木材的防腐等级达到Ⅱ级耐腐，在50 g/L时达到Ⅰ级耐腐；对氯肉桂醛当浓度为20 g/L时，达到Ⅱ级耐腐，当浓度为60 g/L时，达到Ⅰ级耐腐。N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺在浓度50 g/L时才实现Ⅱ级耐腐，浓度为90 g/L时达到Ⅰ级耐腐。

可见，对密粘褶菌，对氯肉桂醛处理材的防腐效果最好，肉桂酸和肉桂醛次之，N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺最弱。对彩绒革盖菌，肉桂酸处理材的防腐效果最好，其次是肉桂醛和对氯肉桂醛，最弱的为N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺。

处理材的防腐结果与滤纸片的抑菌结果存在偏差，滤纸片法中肉桂醛和N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺均表现出很好的抑菌性，而在处理材的防腐性能方面并没有得到预期的防腐效果，原因可能是肉桂醛在空气中易被氧化成肉桂酸，并且易随水蒸气挥发[16]，在处理材水蒸气灭菌时肉桂醛随水蒸气挥发掉一部分，而且在长时间的防腐过程中有部分肉桂醛被氧化成肉桂酸，处理材中残留的肉桂醛浓度降低而导致防腐性能变差。而N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺是席夫碱，席夫碱的稳定性差，遇水容易水解。它的耐腐效果较差可能是在水蒸气灭菌和长时间防腐中药剂分解而使有效浓度降低造成的。

2.3 处理材对霉菌的防霉性能

肉桂醛类化合物对黑曲霉和桔青霉的防霉结果见表2和表3。由表2和表3可知，无水乙醇空白和无菌水空白被害值为4，说明供试菌种活性符合要求，并且说明使用乙醇为溶剂对实验结果无影响。

由表2可知，木材试样经4种肉桂醛类化合物处理后均有一定的防霉性能，且随着药液浓度的增大，木材试样受黑曲霉侵害的被害值降低，防霉效果越显著；从防霉等级来看，相同浓度下的肉桂醛和对氯肉桂醛的防霉效果较好，均在浓度为32.79 g/L时被害值由4降到2，在浓度为68.67 g/L时被害值由2降为1。其余2种化合物的防霉效果均弱于肉桂醛，被害值均在2以上。

表2 肉桂醛类化合物对黑曲霉的防霉结果

由表3可知，使用无菌水和无水乙醇处理的空白试样桔青霉生长旺盛，感染面积达到90%，被害值均为4，表明用乙醇作溶剂对实验结果无影响。从表中可知，肉桂醛与对氯肉桂醛的防霉效果较好，具有较强的抗桔青霉活性，在浓度为16.13 g/L时即能使被害值降为1，而在浓度为68.67 g/L时能完全防止霉变。其余2种化合物对桔青霉的抑制作用稍弱。但是总的来看，对桔青霉的防霉效果优于对黑曲霉的效果。

表3 肉桂醛类化合物对桔青霉的防霉结果

此外，由于这4种肉桂醛类化合物的水溶性均较差，这对于化合物的抗流失性有利，但抗流失性具体如何，今后还需进一步研究，为其在木材防腐领域的应用提供依据。

3 结 论

4种肉桂醛类化合物处理材对密粘褶菌和彩绒革盖菌均具有一定的抑制作用，对试材均起到了不同程度的保护作用。对密粘褶菌的防腐，对氯肉桂醛处理材的效果最好，在浓度为40 g/L时即达到Ⅰ级耐腐；肉桂酸和肉桂醛次之，浓度均为50 g/L时达到Ⅰ级耐腐；N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺最弱，在90 g/L时达到Ⅰ级耐腐。对彩绒革盖菌的防腐，肉桂醛和肉桂酸在浓度为50 g/L时达到Ⅰ级耐腐，对氯肉桂醛在60 g/L达到Ⅰ级耐腐，最弱的为N,N′-二反式对氯肉桂醛-1,2-乙二胺在90 g/L时达到Ⅰ级耐腐。

4种肉桂醛类化合物处理材对木材霉菌中的黑曲霉和桔青霉也具有较好的防霉效果，能够有效地防止木材霉变发生。其中，对氯肉桂醛与肉桂醛对黑曲霉和桔青霉的防霉效果最好，特别是对桔青霉，在浓度为68.67 g/L时均能够完全保护木材不被桔青霉霉变。

[1]KUMUDAVALLY K V, TABASSUM A, RADHARISHNA K, et al. Effect of ethanolic extract of clove on the keeping quality of fresh mutton during storage at ambient temperature (25±2℃)[J]. Journal of Food Science and Technology, 2011, 48(4):466-471.

[2]DAS M, RATH C C, MPHAPATRA U B. Bacteriology of a most popular street food (Panipuri) and inhibitory effect of essential oils on bacterial growth[J]. Journal of Food Science and Technology, 2012, 49(5):564-571.

[3]DUKE J A. Handbook of medicinal herbs[M]. Boca Raton Fla.: CRC Press, 2002: 221-222.

[4]BOWLES B L, MILLER A J. Antibotulinal properties of selected aromatic and aliphatic aldehydes[J]. Journal of Food Protection, 1993, 56(9):788-794.

[5]BOWLES B L, SACKITEY S K, WILLIAMS A C. Inhibitory effects of flavor compounds onStaphylococcusaureusWRRC B124[J]. Journal of Food Safety, 1995, 15(4):337-347.

[6]BASSOLÉN H I, JULIANI R H. Essential oils in combination and their antimicrobial properties[J]. Molecules, 2012, 17(4):3989-4006.

[7]HELANDER I M, ALAKOMI H, LATVA-KALA K, et al. Characterization of the action of selected essential oil components on gram-negative bacteria[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(9):3590-3595.

[8]BAKKALI F, AVERBECK A, AVERBECK D, et al. Biological effects of essential oils—a review[J]. Food Chemical Toxicology, 2008, 46(2):446-475.

[9]LEE H S, AHN Y J. Growth-inhibiting effects of cinnamomum cassia barkderived materials on human intestinal bacteria[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(1):8-12.

[10]SIDDIQUA S, ANUSHA B A, ASHWINI L S, et al. Antibacterial activity of cinnamaldehyde and clove oil: effect on selected foodborne pathogens in model food systems and watermelon juice[J]. Food Science and Technology, 2015, 52(9):5834-5841.

[12]李红良, 祝团结, 何松, 等. 肉桂醛复配型防腐剂在麻辣休闲素食品中的应用研究[J]. 食品科技, 2011, 36(4):219-222. LI H L, ZHU T J, HE S, et al. Application of cinnamic aldehyde compound preservativesin spicy leisure vegetarian foods[J]. Food Science and Technology, 2011, 36(4):219-222.

[13]张彬, 江娟. 肉桂醛-大豆分离蛋白可食膜的抑菌及其对冷鲜猪肉的保鲜[J]. 食品科学, 2011, 32(增刊):106-112. ZHANG B, JIANG J. Antimicrobial and preservation of chilled pork of cinnamaldehyde-soy protein isolate edible films[J]. Food Science, 2011, 32(Supp.):106-112.

[14]MAKWANA S, RUPTAL C, NAVNEET D, et al. Nanoencapsulation and immobilization of cinnamaldehyde for developing antimicrobial food packaging material[J]. LWT-Food Science and Technology, 2013, 57(2):470-476.

[15]BANG K, LEE D, PARK H, et al. Inhibition of fungal cell wall synthesizing enzymes by trans-cinnamaldehyde[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2000, 64(5):1061-1063.

[16]孙罗美, 邹胜龙. 肉桂醛的研究与应用[J]. 广东饲料, 2012, 21(12):29-31. SUN L M, ZOU S L. Research and application of cinnamaldehyde[J]. Guangdong Feed, 2012, 21(12):29-31.

[17]YUAN H J, WANG H, LI Z, et al. Synthesis and antifungal property of N,N′-bis(trans-cinnamaldehyde)-1,2-diiminoethane and its derivatives[J]. Toxicological & Environmental Chemistry, 2015, 97(3/4):429-438.

[18]LI S, FREITAG C, MORREL J J. Preventing fungal attack of freshly sawn lumber using cinnamon extracts[J]. Forest Products Journal, 2008, 58(7/8):77-81.

Decay and mould resistance of cinnamaldehyde and its derivatives

YANG Dongmei1, WANG Hui1, LI Shujun1*, YUAN Haijian1,2

(1.KeyLaboratoryofBio-basedMaterialScienceandTechnologyoftheMinistryofEducation,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China;2.DepartmentofLandandResourcesofHeilongjiangProvince,Harbin150090,China)

Cinnamaldehyde, which naturally exists in the world, has a broad-spectrum antifungal activity. In order to develop an environmentally friendly and effective preservative against wood decay and mould fungi, decay and mold resistant abilities of cinnamaldehyde and its three derivatives were examined by a filter paper disk method and wood block laboratory tests. The result of the filter paper disk method showed that among the four compounds, cinnamaldehyde presented the best antifungal activities against all the four selected fungi, i.e.,Gloeophyllumtrabeum,Trametesversicolor,AspergillusnigerandPenicilliumcitrinum. In the decay resistance experiment againstGloeophyllumtrabeum, 4-chlorocinnamaldehyde showed the best performance and the treated wood could be ranked as Grade Ⅰ of wood decay resistance at the concentration of 40 g/L. Cinnamic acid presented better decay resistance than cinnamaldehyde, and the treated wood could be ranked as Grade Ⅱ of wood decay resistance at the concentration of 10 g/L. The treated wood could not be ranked as Grade Ⅱ until the cinnamaldehyde concentration was up to 20 g/L. In decay resistance experiments againstTrametesversicolor, the wood treated with 50 g/L cinnamaldehyde or cinnamic acid could be ranked as Grade Ⅰ. As for mould resistance, cinnamaldehyde and 4-chlorocinnamaldehyde presented the best performance againstAspergillusnigerandPenicilliumcitrinum, especially the latter mould fungous. Both cinnamaldehyde and 4-chlorocinnamaldehyde prevented the treated wood from the growth ofPenicilliumcitrinumtotally at a concentration of 68.67 g/L. As toAspergillusniger，at the same concentration, both cinnamaldehyde and 4-chlorocinnamaldehyde presented good resistant abilities with little infected area. Cinnamaldehyde and the derivatives showed high decay and mold resistant abilities, and are environmentally friendly. Therefore, they have great application potential in wood preservation.

cinnamaldehyde; cinnamaldehyde derivatives; antifungal; wood decay fungi; mould

2016-06-12

2016-11-05

教育部博士点基金资助项目(20130062110003)。

杨冬梅，女，讲师，博士，研究方向为木材防腐剂的开发。通信作者：李淑君，女，教授。E-mail:lishujun@nefu.edu.cn

S782.33

A

2096-1359(2017)01-0046-05