电针额区对血管性痴呆大鼠行为学及脑内cAMP-PKA-CREB信号通路的影响*

马 莉,王诗陶,刘 征△

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

电针额区对血管性痴呆大鼠行为学及脑内cAMP-PKA-CREB信号通路的影响*

马 莉1,王诗陶2,刘 征1△

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨电针额区对血管性痴呆(VD)大鼠脑内海马区cAMP-PKA-CREB信号通路的影响。方法：选取60只健康雄性老龄Wistar大鼠，随机分成假手术组、电针组、模型组和西药组，每组15只，共4组。动物模型的制作方法采用2-血管阻断法(2-VO)，待大鼠伤口愈合后给予相关治疗。电针组选取VD大鼠头部额区的穴位神庭透至囟会，同时在此穴的基础上各旁开1寸及2寸(参照于致顺老师头穴分区法)给予丛刺，连接KWD-808 I型脉冲电疗仪，采用疏密波，2 Hz频率，电针20 min，之后再留针10 min，每日治疗1次，共30天。西药组给予脑复康治疗，假手术组和模型组给予生理盐水灌胃治疗。每组大鼠采用Morris水迷宫进行行为学能力的检测，并采用SABC法检测海马区cAMP的含量，同时采用免疫印迹法检测海马区PKA及CREB蛋白表达的变化。结果：与模型组比较，电针额区明显提高了VD大鼠Morris水迷宫的检测成绩，使海马区cAMP的含量升高，并显著增加PKA、CREB的阳性细胞数量(P<0.05);而电针组与西药组比较各指数无统计学意义(P>0.05)。结论：电针额区可以有效改善VD大鼠的记忆能力，提高其学习成绩，调整VD大鼠海马区cAMP-PKA-CREB信号通路的传导。

电针；痴呆;血管性；Morris水迷宫；cAMP-PKA-CREB

血管性痴呆(VD)是老年期痴呆之一，是目前唯一可预防和治疗的痴呆类型，以学习记忆障碍为主要表现，其病因多为各种脑血管疾病。随着世界人口的老龄化及中风发病率的升高，该病已成为医学界的重大研究课题。临床中笔者采用本校于致顺老师的头穴分区丛刺法，并结合脉冲电疗仪治疗该病，疗效较为显著。为了进一步揭示该方法的作用机理，笔者利用2-血管阻断法(2-VO)制作VD模型[1]，观察针刺前后VD大鼠cAMP-PKA-CREB信号传导通路的变化。

1 材料与方法

1.1 实验器材

TGL-16G冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；1510石蜡切片机(德国LETIZ公司)；722光栅分光光度计(上海第二分析仪器厂)；电动玻璃匀浆机(宁波新芝科学仪器研究所)；YW-90旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；无菌针灸针(贵州安迪药械有限公司生产)；KWD-808 I脉冲电疗仪(常州市武进长城医疗器械有限公司)；TS-1型脱色摇床(江苏海门麒麟医用仪器厂)；Morris水迷宫仪。

1.2 实验动物

选用健康雄性老龄Wistar大鼠60只，月龄为18～20，体质量为(500±20)g。

1.3 分组和造模方法

将60只Wistar大鼠随机分为4组，即假手术组、电针组、模型组和西药组，每组大鼠15只。实验动物在适应实验室条件1周后开始造模。造模方法采用改进的2-VO阻断法。各组大鼠采用10%乌拉坦(1 g/kg)进行腹腔注射麻醉，然后颈部给予常规消毒，在颈部正中行切口，充分暴露左右颈总动脉和神经，将二者进行钝性剥离，随即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，之后恢复供血10 min，再夹闭10 min，最后取下无创动脉夹并缝合伤口。术后每只大鼠给予20万u青霉素肌注以预防感染。假手术组采取钝性分离动脉和神经后即缝合伤口。

1.4 治疗方法

待4组Wistar大鼠伤口完全愈合后分别给予相关治疗。按照于致顺老师头穴分区法，电针组VD大鼠采用额区穴位给予丛刺，即从神庭透至囟会(参照《实验动物针灸穴位图谱》)及其向左、右各1寸及2寸的平行线，连接脉冲电疗仪，调至2 Hz，疏密波，持续20 min，撤下电疗仪，留针10 min，每日治疗1次，共30天。西药组VD大鼠给予6 ml/kg灌胃治疗，药物为脑复康(湖南迪诺制药有限公司，批号H43020666)水溶液灌胃，其水溶液配比浓度为40 mg/ml。假手术组和模型组给予同等剂量的生理盐水灌胃。

1.5 Morris水迷宫检测

待各组大鼠治疗结束后，利用Morris水迷宫进行行为学能力检测，根据其检测成绩判断各组大鼠的学习记忆力能力。该测试历时6天，每天上、下午各进行4次，分为定位航行试验和空间探索试验。在定位航行试验中，将大鼠放入水迷宫计算其2 min内到达平台的时间，即为该大鼠的逃避潜伏期，如果2 min内仍未找到平台，其逃避潜伏期为2 min。该试验结束后，将平台撤掉后开始进行空间探索试验，把各组大鼠从Morris水迷宫的任意入水点放入水中，观察大鼠的运行轨迹，同时计算Wistar大鼠在2 min内在原象限平台的跨越次数。

1.6 海马cAMP含量及PKA、CREB蛋白的检测

各组大鼠行为学测试后，被断头处死，在冰盘上迅速取双侧海马组织，置于-70℃下液氮保存，按照cAMP试剂盒的说明采用放射免疫法对其含量进行检测，并利用SABC法对CREB、PKA的阳性蛋白进行测定。

1.7 数据处理

2 实验结果

2.1 Morris水迷宫检测结果

见表1。模型组大鼠逃避潜伏期明显长于假手术组，二者差异显著(P<0.01)，空间探索试验中模型组大鼠跨越原象限平台的次数少于假手术组，说明造模成功；电针组、西药组大鼠的数据与模型组比较，有统计学意义(P<0.05)，两组大鼠的逃避潜伏期均比模型组显著缩短，其跨越次数也较模型组明显增多；电针组与西药组比较，行为学统计无明显差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期、跨越次数的比较(±s)

注:与模型组比较，△P<0.01,▲P<0.05；与电针组比较，▽P>0.05

2.2 各组大鼠cAMP含量检测的结果

见表2。模型组大鼠与假手术组比较，其海马区cAMP的含量明显减少，有统计学意义(P<0.01)，电针组、西药组与模型组比较其cAMP的含量均明显增加，差异显著(P<0.05)，电针组与西药组cAMP的含量比较无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠cAMP的检测结果(±s)

注:与假手术组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05；与电针组比较，▽P>0.05

2.3 各组大鼠PKA、CREB阳性蛋白表达结果

见表3。光镜下，PKA和CREB的阳性表达呈棕黄色颗粒状物，且主要集中在海马CA1区。假手术组PKA及CREB的阳性细胞数量明显多于模型组，二者比较具有统计学意义(P<0.01)；治疗后，电针组与西药组PKA及CREB阳性细胞数量均比模型组明显增加,与模型组比较有显著差异(P<0.01);电针组PKA及CREB与西药组比较无差异(P>0.05)。

表3 各组大鼠PKA、CREB蛋白表达的比较(±s)

注:与假手术组比较，△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01；与电针组比较，▽P>0.05

3 讨论

由于VD的病位在脑髓，故临床中治疗本病以头部腧穴为主。我校于致顺老师利用“场说”将头部划分为7个区，来治疗相关疾病，为临床提供了简便有效的方法。针对智能及精神类疾病，笔者通常选取头部额区进行针刺[2]，即神庭至囟会及其向左、向右、各1寸及2寸的平行线，该方法不仅能够有效改善脑部神经细胞代谢，同时还能提高VD患者的记忆力和智能状态。

VD属于老年期痴呆之一，因此选取的实验动物应与人类VD的病理生理特点相接近。本研究中，选取老龄Wistar大鼠，采用改进的2-VO法[3]，较好的模拟了VD的发病机制。造模前后利用Morris水迷宫[4]进行行为学能力检测，根据其检测成绩判断各组大鼠的智能和记忆改变。实验结果提示模型组大鼠比假手术组大鼠的逃避潜伏期明显延长，撤除平台后，VD大鼠无法正确搜寻目标，跨越原象限平台的次数显著减少，提示其空间认知能力出现下降，记忆力明显减退。电针额区治疗后，VD大鼠的逃避潜伏期大大缩短，运动轨迹也较前清晰，原象限平台的跨越次数明显增加，说明电针额区能够有效提高VD大鼠的空间认知能力，改善VD大鼠的记忆及智能状态。

蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)信号通路即cAMP-PKA-CREB通路参与人体内多种能量代谢过程[5]，且与学习记忆尤其是海马依赖长时程记忆增强关系密切。PKA是作用在中枢神经系统的重要调控因子之一，该通路对神经突触的可塑性及神经活性物质的合成代谢均发挥着重要作用，此外也影响基因的表达调控。Byers等[6]通过研究证实，细胞内cAMP数量不论增加或减少均可使动物产生不同程度的记忆力减退。此外还有人发现应用PKA抑制剂不仅能阻断动物脑内的信号通路传导[7]，还会对大脑的长时程记忆造成严重损伤。多数学者经实验证实[8-9]，VD大鼠的海马区神经元在急性脑缺血时会导致离子泵功能障碍，大量自由基过度内流，cAMP的生成数量下降，PKA的激活明显减少，进而抑制CREB产生磷酸化，阻碍CREB与cAMP反应元件的进一步结合，无法启动和调控下游转录因子，使其产生新的神经突触联系，最终导致学习记忆障碍。笔者在实验中发现，VD大鼠经电针额区治疗后，脑内cAMP数量明显升高,PKA及CREB阳性蛋白表达增加，行为学有所改善，证实三者的含量与大鼠的学习记忆成绩呈正相关，该信号通路的弱化直接参与了VD的形成，而电针额区能够激活该信号通路的传导，提高VD大鼠的认知记忆能力，最终改善动物的整体智能状态。

[1] Samdani A,Danson TM,Dawson VL,et al.Nitric oxide synthase in model of focal ischemia[J].Stroke,1997,28:1283-1288

[2] 王薇，周国滨，于致顺.于致顺主任医师头针治疗经验[J].中国中医药现代远程教育，2003，33(6)：28-31

[3] 王蕊.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进[J].中国病理生理杂志，2000，16(10)：914-916

[4] Morris R.Development of a water-maze Procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods,1984,11(1)47-60

[5] Nishiyama M,Hoshino A,Tsai L,et al.Cyclic AMP /GMP-dependent modulation of Ca2+channels sets the polarity of nerve growth-cone turning[J].J Nature,2003,423(6943):990-995

[6] Byers D,Davis RL,Kiger JA.Defect in cyclic AMP phos-phodiesterase due to the dunce mutation of learning in dro-sophila melanogaster[J]. Nature,1981,289(5793):79-81

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Effect of Electric Acupuncture on the Behavior of Vascular Dementia Rats and Activity of cAMP-PKA-CREB in Hippocampus

MA Li1,WANG Shi-tao2,LIU Zheng1△

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective：To research the possible mechanism of electric acupuncture on frontal area of vascular dementia (VD) rats and to study the effect on cAMP-PKA-CREB signal pathways in hippocampus.Methods：60 male aging Wistar rats were randomly divided into a control group,a model group,an electric acupuncture group and a medicine group. In the experiment,we adopted 2-VO to duplicate VD models and used electric acupuncture treatment on the frontal area of rats’ heads for 30 days according to professor YU Zhi-shun’s treatment.By the end of the study,we examined the memory ability of rats according to Morris test and cAMP-PKA-CREB expressions were detected by western blot method.SPSS 16.0 software was applied to the available data for analysis and process.Results：Compared with model group,electric acupuncture treatment could obviously increase the scores of VD rats in Morris test.The treatment could significantly increase the number of cAMP and improve the expression of PKA-CREB.Conclusion：Electric acupuncture treatment can effectively improve the memory ability of VD rats,and adjust the cAMP-PKA-CREB signal pathway in the hippocampus of VD rats.

Electric acupuncture;Dementia;Vascular;Morris water maze;cAMP-PKA-CREB

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号:12531654。

马莉(1972-),女，副主任医师，硕士研究生导师，从事针灸临床与科研工作。

△通讯作者：刘征(1978-),男，副主任医师，硕士研究生导师，从事针灸临床工作。

R246.6

A

1005-0779(2017)01-0050-03

2016-06-22