针刺“足三里”穴对脾气虚模型大鼠下丘脑及小肠组织CCK、CCK-AR表达的影响*

薛亚楠，曲 怡，王建波，李欣欣，勇入琳，张立德△

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110847)

针刺“足三里”穴对脾气虚模型大鼠下丘脑及小肠组织CCK、CCK-AR表达的影响*

薛亚楠1，曲 怡2，王建波1，李欣欣1，勇入琳1，张立德1△

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110847)

目的：观察电针双侧“足三里”穴对脾气虚模型大鼠下丘脑及小肠组织胆囊收缩素(CCK)及其受体(CCK-AR)表达的影响。 方法：随机将40只SD大鼠分为4组，即正常组、脾气虚组、足三里组和非经非穴组，每组10只。除正常组外，其余3组均采用力竭游泳和不规则饮食复合法建立脾气虚证大鼠模型。依据造模评定标准造模成功后，足三里组给予电针大鼠双侧“足三里”穴干预处理，采用疏密波，1次/天，20 min/次，连续6天；治疗结束后，10%水合氯醛腹腔麻醉，取下丘脑及小肠组织，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠小肠组织CCK含量变化，荧光定量PCR法检测大鼠小肠及下丘脑组织CCK及CCK-AR mRNA表达水平。结果：脾气虚组和非经非穴组下丘脑及小肠组织中CCK 、CCK-AR mRNA表达水平明显高于正常组(P<0.05)；足三里组下丘脑及小肠组织中CCK及CCK-AR mRNA表达水平相比于脾气虚组降低(P<0.05)，非经非穴组未见显著性差异(P<0.05)。结论：针刺“足三里”穴可以调节脾气虚大鼠小肠及下丘脑组织CCK及CCK-AR的异常分泌，发挥其外周和中枢效应对脾气虚证起调控作用。

针刺；足三里；小肠；下丘脑；CCK

早期研究证实[1]，足三里穴作为胃经常用穴位，针刺不仅可以消除上腹胀痛、恶心、嗳气等，还可以通经活络、调畅气血，调节脾胃功能。胃肠激素作为一种调节肽，对胃肠生理功能有着重要的调节作用。已有研究表明脾虚时消化系统处于紊乱的病态，胃肠激素在其中发挥着重要作用。CCK作为胃肠激素和神经肽，广泛分布于消化系统、中枢及外周系统等组织器官中，故本实验以脾气虚大鼠为对象，研究电针双侧“足三里”穴对脾气虚证大鼠CCK和CCK-AR的干预效应，以揭示“足三里”穴对脾气虚证的调控机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雄性SPF级SD大鼠40只，体质量(200～220)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 试剂

大鼠胆囊收缩素(CCK)ELISA试剂盒，引物设计合成(北京博迈德基因技术有限公司)，PCR反转试剂盒(ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit)，荧光定量PCR试剂盒(Agilent Technologies)，Trizol®Reagent(Invitrogen life technologies)，无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，无核酸酶水(由500 ml超纯水和0.5 ml DEPC混合后过夜，并高压灭菌)，氯仿(安徽时联特种溶剂股份有限公司)，异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)。见表1。

表1 引物信息

1.3 主要仪器

华佗牌针灸针(0.25 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司)，华佗牌电子针疗仪(SDZ-Ⅱ型，苏州医疗用品厂有限公司)，荧光定量PCR仪(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm),梯度PCR扩增仪(Applied Biosystems),超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000),多功能酶标仪(SpectraMax I3 奥地利MD公司)。

2 方法

2.1 分组与造模

适应性饲养1周后，用随机数字表法[2]将大鼠分为正常组、脾气虚组、足三里组、非经非穴组，每组10只。正常组每日自由进食饮水；其余组采用力竭游泳及饮食不节的复合因素建立脾气虚证候模型：先饱食1天，再禁食2天，每日自由饮水，3天为一周期，并每日于水温35℃～37℃的水槽中游泳，以力竭(即大鼠鼻尖没入水面10 s)为度，1次/天。5个周期后造模结束。

2.2 干预方法

造模结束后，足三里组用0.25×13 mm毫针针刺大鼠双侧膝关节外侧腓骨小头下3.5 mm “足三里”穴，直刺5 mm，连接电针仪，采用疏密波，频率2 Hz/15 Hz，每日1次，每次20 min，连续6天；非经非穴组在双侧髂脊上10～15 mm、后正中线旁开20 mm区段内选择1个固定对照点确定为非经非穴点[3]，平刺8～10 mm，给予同等条件下的电针处理，持续6天。

2.3 标本采集与检测

各组大鼠均于末次电针干预处理后，禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(3 ml/kg体重)，取小肠、下丘脑组织，液氮浸泡后冻存于-80℃冰箱待用。

2.4 ELISA法检测小肠组织CCK蛋白含量

取小肠组织0.1 g，加入PBS溶液制成10%组织匀浆液，组织研磨后离心取上清；严格按照ELISA试剂盒说明书操作，在450 nm波长下测定各孔OD值，以浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，按照曲线方程计算各样本浓度。

2.5 实时荧光定量PCR法检测小肠组织CCK、CCK-AR基因表达水平

取适量下丘脑、小肠组织0.1 g，用Trizol法提总RNA；采用超微量紫外分光光度计测定260 nm、280 nm、OD260/OD280比值及RNA浓度。反转录合成cDNA，反转条件：25℃ 10 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min；荧光定量PCR仪进行基因表达量的检测，每个反应体系总体积为20 μL，反应参数：预变性95℃ 10 min，变性95℃ 30 s，退火59℃ 30 s，共40个循环。

2.6 统计学方法

3 实验结果

3.1 各组大鼠一般情况

正常组大鼠始终反应灵敏、饮食量正常、被毛浓密有光泽、粪便呈棕褐色颗粒状。其余组大鼠随着造模时间的延长，逐渐出现食量减少、神疲乏力、喜扎堆、被毛枯槁无华、体重下降等“脾气虚”症状；经电针干预处理后，足三里组大鼠上述症状减轻，反应较之前灵敏，食欲转好，食量增加，被毛疏散但有光泽，粪便呈颗粒状；非经非穴组未见明显改善。

3.2 各组大鼠小肠组织CCK含量

统计结果显示：与正常组相比，脾气虚组大鼠小肠组织CCK含量升高(P<0.05)；与脾气虚组比较，足三里组大鼠小肠组织CCK含量降低(P<0.05)，非经非穴组大鼠未见显著性差异(P>0.05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠小肠组织CCK平均含量(±s)

注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

图1 各组大鼠小肠组织CCK含量比较(n=10，±s)注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

3.3 各组大鼠小肠组织CCK及CCK-AR的mRNA表达

统计结果显示：与正常组相比，脾气虚组大鼠小肠组织CCK及CCK-AR的mRNA表达上调(P<0.05)；与脾气虚组相比，足三里组大鼠小肠组织CCK及CCK-AR的mRNA表达下调(P<0.05)，非经非穴组未见显著性差异(P>0.05)。见表3、图2。

表3 各组大鼠小肠组织CCK及CCK-AR的mRNA表达(±s)

注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

图2 各组大鼠小肠组织CCK及CCK-AR的mRNA表达(n=10，±s)注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

3.4 各组大鼠下丘脑组织CCK及CCK-AR的mRNA表达

统计结果显示：与正常组相比，脾气虚组大鼠下丘脑组织CCK及CCK-AR的mRNA表达上调(P<0.05)；与脾气虚组相比，足三里组大鼠下丘脑组织CCK及CCK-AR的mRNA表达下调(P<0.05)，非经非穴组未见显著性差异(P>0.05)。见表4、图3。

表4 各组大鼠下丘脑组织CCK及CCK-AR的mRNA表达(±s)

注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

图3 各组大鼠下丘脑组织CCK及CCK-AR的mRNA表达(n=10，±s)注：与正常组比较，●P<0.05；与脾气虚组比较，▲P<0.05

4 讨论

传统医学认为，脾主运化即指脾将水谷化为精微物质，并将其转输至全身脏腑组织的功能，实际就是脾对营养物质的消化、吸收和运输的功能。即西医所说的消化功能，所以，一旦脾主运化功能失调就会使消化吸收障碍，产生便溏、倦怠乏力等相应病证[4]。脾气虚证是中医临床常见证候之一，《内经》就曾提到过脾气虚证所涉及的症状以及与现代医学相关的消化系统疾病，表现居多为胃肠道消化吸收功能低下、胃排空加速等症状。研究表明[5-7]，胃肠激素分泌紊乱是导致胃肠功能障碍和脾虚证发生的原因之一，脾气虚大鼠体内存在SS、SP、CCK等胃肠激素表达的异常。脾气虚CCK含量的改变及其受体敏感性的变化，常引起消化道动力性疾病的发生[8-9]。本实验通过观察电针刺激脾气虚大鼠双侧“足三里”穴对小肠及下丘脑组织中CCK及CCK-AR表达的影响，进一步探讨“足三里”穴对脾气虚证的调控机制。

CCK是由十二指肠和空肠Ⅰ细胞合成分泌的多肽激素，广泛分布于胃肠道和中枢神经系统，除了促进胆囊收缩外，还可以调节胰酶的分泌、胃肠蠕动、抑制胃酸分泌，参与饱腹信号的传导，对消化道有广泛、重要的调节作用[8,10-11]。早期研究显示[8,12-13]：CCK产生明显的外周和中枢效应，胃和迷走神经是其外周作用部位。在外周，CCK的饱和效应一方面通过CCK-AR刺激迷走神经介导，另一方面通过促进胆囊收缩、胰酶分泌和脂肪的消化吸收而抑制进食，且浓度与胃的排空率呈反比关系。实验证实[14-15]，使用CCK-AR可抵消高脂饮食引起的进食量的降低和饱腹感。CCK作为中枢神经递质，被认为是一种饱感因子，是一个重要的“饱食中枢兴奋”信号，不仅能与其他摄食相关神经递质相互作用，还能通过介导CCK-AR对中枢摄食和饱腹感起调节作用。脾虚造模组在血浆和组织中均有CCK浓度升高，抑制胃肠运动[16-19]。

本次实验结果显示，脾气虚组大鼠表现为倦怠乏力、食欲下降、体重减轻，CCK及CCK-AR在下丘脑和小肠组织中表达均有所提高，CCK抑制胃动力，产生饱腹感而减少进食，其作用结果与脾气虚模型动物消化功能下降吻合。一方面是通过它对胃肠道的直接作用，另一方面是通过与CCK-AR结合在中枢发挥作用而实现的。电针刺激“足三里”穴能明显降低脾气虚大鼠下丘脑和小肠组织CCK及CCK-AR的表达水平，从上述CCK的生理作用来看，这可能有利于促进胃排空、缩短胃排空时间、增强食欲、增加进食量，进而改善脾气虚大鼠食欲下降、摄食减少、体重减轻等症状，从而起到一定的调控作用。

[1] 孙亦农.《灵枢经》中足三里穴的治疗作用[J].南京中医学院学报,1994(6):37-38

[2] 苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版社,1997:142

[3] 林莺,纪峰,黄桂榕,等.针刺实验研究中大鼠非经非穴选取方法及思考[J].针刺研究,2013(4):334-338

[4] 蔡琴,程东庆.中医脾虚证本质的中西医结合研究进展[J].亚太传统医药,2009,5(10):133-136

[5] 孙晓芬,程卫东,段永强,等.脾虚大鼠血清及胃组织中胃肠激素SS、GAS和CCK的变化及中药干预研究[J].时珍国医国药,2014,25(3):756-758

[6] 段永强,程卫东,杜娟,等.四君子汤对脾气虚大鼠SP/CCK和Mapk14mRNA表达水平的影响[J].中药材,2014,37(4):656-660

[7] 费晓燕,谢建群,郑昱,等.疏肝饮对腹泻型肠易激综合征模型大鼠胃动素和胆囊收缩素的影响[J].上海中医药杂志,2008,42(4):63-65

[8] 邹百仓.胆囊收缩素与消化道运动[J].国外医学·消化系疾病分册,2002,22(2):112-115

[9] Rehfeld JF.The New Biology of Gastrointestinal Hormones[J].Physiol Rev，1998,78(4)：1087-1108

[10] 严茂祥,陈芝芸,项柏康.脾虚证大鼠血及结肠组织胃肠激素的变化[J].中国医药学报,2003(2):71-72

[11] Thomas RP, Hellmich MR,Townsend CM JR,et al.Role of gastrointestinal hormones in the proliferation of normal and neoplastic tissues[J].EndocrRev,2003,24(5):571-599

[12] Yuan CS,Attele AS,Dey L,et al.Gastric effects of cholecystokinin and its interaction with leptin on brainstem neuronal activity in neonatal rats[J].J Pharmacol Exp Ther,2000,295(1):177-182

[13] McMinn JE,Sindelar DK,Havel PJ,et al.Leptin deficiency induced by fasting impairs the satiety response to cholecystokinin[J].Endocrinology,2000,141(12):4442-4448

[14] Matzinger D,Degen L,Drewe J,et al.The role of long chain fatty acids in regulating food intake and cholecystokinin release in humans[J].Gut,2000,46:688-693

[15] 于文靖,陈苏宁,李慎贤,等.胃痛消痞方对功能性消化不良大鼠血清及胃肠组织中CCK、VIP的影响[J].实用药物与临床,2012,15(8):461-463

[16] Sheng B,MoranTH.Actionsof CCKin the controlsof food intake and body weight:lessons from the CCK-A receptor deficient OLETF rat[J].Neuropeptide,2002,36(2-3):171-181

[17] Pan XZ,Cai LM.Current status of gastrointestinal hormones[J].Shijie huaren xiaohua zazhi,1999,7:464-466

[18] Bi S,Scott KA,Kopin AS,et al.Differential roles for cholecystokinin A receptors in energy balance in rats and mice[J].Endocrinology,2004,145(8):3873-3880

[19] Hidalgo L,Clara P,Estorch M,et al.Effect of cholecystokinin_A receptor blockade on postprandial insulinaemia and gastric emptying in humans[J].Neurogastroenterol Motil,2002,14(5):519-525

Effect of Acupuncture at “Zusanli”(ST36) on the Expression of CCK and CCK-AR in the Small Intestine and Hypothalamus in Rats with Spleen Qi Deficiency Syndrome

XUE Ya-nan1,QU Yi2,WANG Jian-bo1,LI Xin-xin1,YONG Ru-lin1,ZHANG Li-de△

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110032,China; 2.KeyLaboratoryofMinistryofEducationofTheoryandApplicationofTCMViscera,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China)

Objective：To observe the effect of electroacupuncture at bilateral “Zusanli” on the expression of cholecystokinin (CCK) and its receptor(CCK-AR) in small intestine and hypothalamus of spleen Qi deficiency model rats.Methods：40 SD rats were randomly divided into four groups,normal group,spleen Qi deficiency group,Zusanli group and non-acupoint group,with 10 in each group.Except the normal group, other three groups received exhaustive swimming and irregular diet to establish the models of spleen Qi deficiency syndrome.Zusanli group was given interventive treatment by acupuncturing at bilateral “Zusanli” after modeling based on the standard for modeling evaluation,using density wave,1 time/d, 20 min/time,lasting six days;after treatment,with 10% chloral hydrate intraperitoneal anesthesia,take out the small intestine and hypothalamus.The changes of CCK content in small intestine tissue of rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Detect CCK and mRNA CCK-AR expression in rats’ small intestine and hypothalamus by fluorescence quantitative PCR.Results：The CCK and CCK-AR mRNA expression levels in hypothalamus and small intestine tissues in spleen Qi deficiency group and non-acupoint group were significantly higher than those in normal group(P<0.05);CCK and CCK-AR mRNA expression levels in hypothalamus and small intestine tissue were significantly decreased in Zusanli group compared with those in the spleen Qi deficiency group (P<0.05).Conclusion：Acupuncture at “Zusanli” can regulate the abnormal secretion of CCK and CCK-AR in small intestine and hypothalamus of rats with spleen Qi deficiency,playing a regulative role of peripheral and central action in the function of spleen Qi deficiency syndrome.

Acupuncture;Zusanli;Small intestine;Hypothalamus;CCK

国家重点基础研究发展计划项目(973计划)，编号：2012CB518503；辽宁省教育厅创新团队项目，编号:LT2014021。

薛亚楠(1991-)，女，2016级针灸推拿专业硕士研究生。

△通讯作者：张立德(1959-)，男，教授，博士研究生导师，研究方向：针刺机理研究。

R245.2

A

1005-0779(2017)01-0046-04

2016-07-04