柏子仁总萜类成分药理活性及提取工艺研究

马欣悦，李瑞海，贾天柱

·药学研究·

柏子仁总萜类成分药理活性及提取工艺研究

马欣悦，李瑞海*，贾天柱

目的 探讨从柏子仁中提取总萜类成分的最佳工艺及总萜类成分的镇静、催眠和耐缺氧作用。方法 以均质时间、温度、料液比和次数4个因素进行考察，每个因素3个水平，采用L9(34)正交试验优选提取工艺。观察柏子仁总萜类成分对小鼠自发活动、戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间和睡眠个数及缺氧小鼠存活时间的影响。结果 以甲醇溶液作为提取溶剂，提取温度80 ℃，料液比1∶10，均质10 min，均质提取1次为最佳提取工艺；总萜类成分能抑制小鼠的自发活动，延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，增加小鼠睡眠个数，延长缺氧小鼠的存活时间。结论 柏子仁总萜类成分具有镇静、催眠和耐缺氧作用；提取方法应用均质法操作简单、效率高，适用于柏子仁总萜类成分的提取。

柏子仁；总萜类化合物；均质；镇静催眠；药理作用

0 引言

柏子仁为柏科绿乔木植物侧柏的种仁，为常用中药。柏子仁味甘，性平，归心、肾、大肠经，有养心安神、敛汗、润肠通便之功[1]。其应用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，《本草纲目》记载：“养心气，润肾燥，安魂定，益智宁神”，用于惊悸怔忡，失眠健忘，盗汗，肠燥便秘[2]。近年来研究者应用均质提取法对植物组织中的萜烯醇、黄酮类物质进行提取，收到了很好的效果。均质提取法提取速度快，温度低，能耗低，目的成分得率高，在中药成分应用的报道很少。目前，柏子仁中总萜类成分的药理活性尚没有全面的报道，因而本研究通过观察柏子仁总萜类成分对小鼠自发活动、戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间和睡眠个数以及缺氧小鼠存活时间的影响，研究柏子仁总萜类成分的镇静、催眠和耐缺氧作用，为其临床应用提供药效学基础。因此，对于柏子仁总萜类成分的提取方法和药理活性的研究具有一定价值。

1 材料

1.1 动物 昆明小鼠，雌雄各半，体重18～21 g，购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.2 药品与试剂 柏子仁总萜类成分提取物(柏子仁总萜类成分含量90%，实验室自制)；柏子仁二萜对照品(含量99.5%，实验室自制)，阳性药物组(安神补脑液，吉林敖东延边药业股份有限公司，批号：201508412)；戊巴比妥钠、甲醇、亚硝酸钠均为分析纯。

1.3 仪器 分光光度计(日本日立)；UV Solutions2.1工作站；ESB-500高剪切均质乳化机(上海易勒机电实验室)；HH-4数显恒温水浴锅(荣华仪器制造有限公司)；超声波提取器(奥特赛恩斯仪器有限公司)；0.000 01 g电子天平(SARTORIUS CP225D)。

2 方法与结果

2.1 柏子仁总萜类成分检测分析方法的建立[3-4]

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取柏子仁二萜标准品12.00 mg，置于100 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品，滤过，取续滤液1 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，备用。

2.1.3 测定方法 精密量取上述供试品溶液0.5 mL，分别置于10 mL的具塞三角瓶中，水浴挥干，各加现配制的高氯酸0.8 mL和冰乙酸5%香草醛溶液0.2 mL，摇匀，60 ℃水浴15 min后，取出转置冰水浴，5 min后精密加入5 mL的冰醋酸，摇匀，静置10 min，以不加柏子仁二萜对照品的随行试剂作为空白，在560 nm波长处测定吸光度，以柏子仁二萜作为对照品，按回归方程计算总萜含量。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL具塞三角瓶中，水浴挥干溶剂，按“2.1.3”项下的方法显色并测定吸光度，以柏子仁二萜的浓度(C，mg/mL)作为横坐标，吸收度(A)作为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：A=28.33 C-0.264，结果显示，以柏子仁二萜为对照的总二萜浓度在0.000 6～0.03 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 常见提取方法的比较[5-7]分别称取4份5 g的柏子仁粉末置于4个锥形瓶中，加甲醇溶液15 mL，分别以超声微波、回流、均质提取法按“2.1.3”项测定，按“2.1.4”项标准曲线测定样品含量。见表1。

表1 常见提取方法的比较(%)

2.3 正交试验优选[5-7]以均质时间、温度、料液比和次数4个因素进行考察，每个因素3个水平，采用L9(34)正交试验优选提取工艺。因素水平见表2。以柏子仁二萜成分为指标，对柏子仁总萜类含量进行评价，进行提取工艺条件优选。正交试验结果见表3。方差分析见表4。

表2 柏子仁总萜类成分提取工艺优选正交试验因素水平

由R值可知，各因素对总萜类成分提取的影响大小顺序为A>D>C>B；方差分析结果A因素均质时间具有显著影响。最后确定提取工艺为A2B2C1D1，即均质时间10 min，温度80 ℃，料液比1∶10，提取1次。

表3 柏子仁总萜类成分提取工艺优选正交试验

表4 方差分析结果

注：F0.05(2.2)=19.00

2.4 重复性实验 按优选的提取工艺提取3批柏子仁总萜，测定其含量，结果为5.99%±0.2% (n=3)。

2.5 柏子仁总萜类成分对小鼠自发活动的影响[8]将50只小鼠按给药不同(雌雄各半)随机分5组：空白组，阳性组(5 μL/g)，柏子仁总萜类成分3个剂量组(0.4、0.8、1.6 mg/g)。各组小鼠灌胃给药，共7 d，灌胃前将小鼠投入木箱中适应20 min，记录2 min内行动累积时间及前肢离地次数，最后1次用药后1 h按同法测定小鼠2 min内的活动数值，见表5。

2.6 柏子仁总萜类成分对药物诱导小鼠睡眠时间的影响[9]取50只小鼠，分组及给药方法同“2.5”，最后1次给药后1 h，继续给药戊巴比妥钠50 μg/g，记录小鼠翻正反射消失前的持续时间，见表6。

表5 柏子仁总萜类成分对小鼠活动的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

表6 柏子仁总萜类成分对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响

注：与空白组比较，**P<0.01

2.7 柏子仁总萜类成分对药物诱导小鼠睡眠的影响[10]取70只小鼠，分组及给药方法同“2.5”，最后1次给药后1 h，继续给药戊巴比妥钠30 μg/g，观察翻正反射消失1 min及以上的小鼠只数。

2.8 柏子仁总萜类成分对张口持续时间的影响[11]取50只小鼠，分组及给药方法同“2.5”，最后1次给药后1 h，依次用大剪刀在小鼠双耳连线处快速断头，并立即用秒表记录断头小鼠的张口动作持续时间，见表7。

表7 柏子仁总萜类成分的耐缺氧作用

注：与空白组比较，**P<0.01

2.9 柏子仁总萜类成分对NaNO2中毒性小鼠存活时间的影响[11]取50只小鼠，分组及给药方法同“2.5”，最后1次给药后1 h，继续给药NaNO2800 μg/g，并立即记录小鼠存活时间，见表7。

3 讨论

3.1 预试验中首先对提取溶剂进行选择 经比较，在甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶剂中，以甲醇含量最高，最后确定其为提取溶剂。预试验中发现，均质提取时间长，提取完全，但超过10 min后，没有明显变化。料液比对于提取有很大影响，预试验中发现，料液比1∶40时，含量不再增加。最后确定，均质时间、温度、料液比和次数4个因素，每个因素3个水平进行考察。

3.2 由表4的R值可知，各因素对总萜类成分提取的影响大小顺序为A>D>C>B；以R值最小的B温度为误差项进行方差分析，结果A因素均质时间对总萜类成分提取具有显著影响，但同时也发现，当达到2水平的时候，含量不再增加，最后确定选择2水平。由于温度、料液比、次数均不是影响实验的主要因素，因此可选择利于生产的水平，温度选择2水平，80 ℃，而料液比高、提取次数多则会增加溶剂量，对于后续的浓缩等操作带来很大的负担，而且会使工艺更加繁琐。故确定提取工艺为A2B2C1D1，即均质时间10 min，温度80 ℃，料液比1∶10，提取1次。

3.3 由表1可知，超声提取、回流提取和均质提取法的含量较高。微波提取法提取成分的含量较低。但有研究显示，微波提取这一新兴提取方法具有很多的优势及发展前途，本实验结果较低，可能是由于使用家用微波炉，对于功率、加热时间等参数都无法进行精确调节，可能造成提取含量较低。超声提取、回流提取和均质提取中，均质提取具有优势，主要表现在，和其他两种方法相比，其操作简单；与回流需要长时间加热不同，均质提取不会破坏热敏性成分，同时能源消耗量较小。与超声提取法相比，均质提取减少了粉碎的环节而且提取时间较短，提取率较高。

3.4 本研究结果表明，与空白组比较，柏子仁总萜类成分3个剂量组(0.4、0.8、1.6 mg/g) 2 min内小鼠行动累积时间和前肢离地次数不同程度减少，睡眠时间、断头小鼠张口持续时间不同程度延长；与空白组比较，柏子仁总萜类成分中、大剂量组(0.8、1.6 mg/g)使小鼠入睡只数增加，NaNO2中毒小鼠存活时间不同程度延长。

3.5 药理实验结果表明，柏子仁中总萜类成分具有良好的镇静催眠和耐缺氧等活性作用，但试验过程中，小鼠的自主性活动有明显的个体差异，不能用统一标准判定是否符合标准，如：上肢举起的高度和幅度等，应在小鼠适应行动箱时注意其活动幅度和上肢举起高度，如有特殊情况及时标记，在正式实验时多加注意。

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Research on pharmacological activity and extracting process of total terpenoids inplatycladiseed

MA Xin-yue,LI Rui-hai*,JIA Tian-zhu

(College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To determine the best technology of extracting total terpenoid components fromplatycladiseedand explore the sedative,hypnotic and hypoxia effect of total terpenoid components.Methods The process of extraction was optimized by L9(34) orthogonal experiment with homogeneous time,temperature,liquid ratio and the times of extraction as factors,three levels in each factor.The effects of total terpenoid components on spontaneous activity of mice,the sleeping time and the number of the sleeping in mice induced by pentobarbital sodium and the survival time of hypoxia mice were observed.Results The best extracting process was as follows:methanol was used as the extraction solvent,extraction temperature was at 80 ℃,material liquid ratio was 1∶10,homogeneous for 10 min,and homogeneous extraction was 1 time.Total terpenoid components could inhibit the spontaneous activity of mice and prolong the sleeping time of mice induced by pentobarbital sodium,increase the number of sleeping mice,and prolong the survival time of mice with hypoxia.Conclusion Total terpenoids components inplatycladiseedhare sedative,hypnotic and hypoxia effect.Homogeneous measure used in the extraction method is simple,efficient and suitable for the extraction of total terpenoid components inplatycladiseed.

Platycladiseed;Total terpenoids;Homogeneous;Sedative hypnotic;Pharmacological effect

2016-05-13

辽宁中医药大学药学院，大连 116600

国家药典委员会，国家药品标准科研项目(201203)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701019

*通信作者