阿司匹林对不稳定型心绞痛患者血浆中5种miRNA水平的影响*

李 云，吕云波，宋银宏

(1.三峡大学医学院，湖北宜昌 443002；2.三峡大学人民医院心内科，湖北宜昌 443002)

阿司匹林对不稳定型心绞痛患者血浆中5种miRNA水平的影响*

李 云1,2，吕云波2，宋银宏1△

(1.三峡大学医学院，湖北宜昌 443002；2.三峡大学人民医院心内科，湖北宜昌 443002)

目的 探讨口服阿司匹林对不稳定心绞痛(UAP)患者血浆miR-21、miR-24、miR-126、miR-146、miR-223水平的影响。方法 以未服用过阿司匹林的15例冠状动脉病变阳性的UAP患者及10例冠状动脉病变阴性的UAP患者作为研究对象，予以阿司匹林肠溶片0.1 g，每日1次口服，实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miRNA浓度，比较服药前及服药1周后外周血浆中这5种miRNA的差异。同时选取50例UAP患者(包括冠状动脉病变阴性及阳性者)，根据其近期是否服用阿司匹林情况分为阿司匹林组及对照组，比较不同组间血浆中5种miRNA水平。结果 仅冠状动脉病变阳性的UAP患者服用阿司匹林后血浆中的miR-223水平升高有统计学意义(P<0.05)，而其他几种miRNA及冠状动脉病变阴性者血浆中5种miRNA水平变化均无统计学意义(P>0.05)。结论 阿司匹林可升高冠状动脉病变阳性的UAP患者血浆中miR-223的水平但不影响冠状动脉病变阴性者血浆miR-223水平。

阿司匹林；冠状动脉疾病；心绞痛，不稳定型；微RNAs

微RNA(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码小分子单链RNA，能通过非特异性识别靶基因mRNA调节生物体的基本生物过程。实验发现miRNA能稳定存在于血浆及体液中。并且，在特定的病理条件下血浆中某些miRNA水平发生相应改变，这提示特定miRNA有望成为新的生物标志物[1-2]。目前有许多miRNA作为生物标志物的研究，然而这些研究很少考虑药物对miRNA的影响。miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223是目前研究较多的几种与血管病变关系密切的miRNA。阿司匹林是一种抗血小板药物，广泛应用于冠心病的预防及治疗。本研究通过检测冠状动脉(简称冠脉)病变阳性及冠脉病变阴性的不稳定型心绞痛(UAP)患者服用阿司匹林前后及近1年内从未服用过阿司匹林和近3个月内坚持服用阿司匹林的UAP患者血浆中miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223的浓度，探讨阿司匹林对血浆中这5种miRNA的影响，评估这5种miRNA作为冠心病生物标志物的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年10月至2015年3月在宜昌市人民医院住院治疗的从未服用过阿司匹林的15例冠脉病变阳性UAP患者及10例冠脉病变阴性UAP患者作为研究对象[入选患者均行冠脉病造影检验，并进行冠脉狭窄程度积分(Gensini)评分。单支主干血管或主要分支病变狭窄大于或等于50%为冠脉病变阳性，否则为冠脉病变阴性。]，每日口服1次阿司匹林肠溶片(拜耳公司)0.1 g，服药前后其他治疗不变，收集患者服用阿司匹林前及服药1周后外周血。

选取2013年10月至2014年12月该院新入院的276例UAP患者，根据其近期服用阿司匹林情况分为阿司匹林组及对照组。取得患者同意后入院时抽取患者静脉血。同时收集患者的一般临床资料及其用药情况，对患者各项生化指标、免疫学指标及血细胞参数进行检验。根据服用阿司匹林情况及冠脉病造影结果将入选者共分为4组：冠脉病变阴性未服用阿司匹林组(A组)、冠脉病变阴性服用阿司匹林组(C组)、冠脉病变阳性未服用阿司匹林组(B组)、冠脉病变阳性服用阿司匹林组(D组)。最后入选并纳入统计者50例。冠脉病变阳性的UAP患者与冠脉病变阴性的UAP患者及UAP患者阿司匹林组与相应对照组(即A组与C组，B组与D组)一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：(1)至少近1年内未服用过阿司匹林或至少近3个月内坚持服用阿司匹林。(2)除高血压、冠心病外无其他全身性器质性疾病。(3)入院前除降压药及阿司匹林外未服用其他可能影响血小板药物。(4)近1周内行冠脉病造影检查。排除标准：急性心肌损伤，急性感染，肝、肾功能不全，肿瘤，风湿免疫性疾病，传染病，糖尿病和间断或近期服用阿司匹林不足3个月者，或近期服用其他可能影响血小板药物者，以及住院期间未行冠脉病造影检查者。本研究获得宜昌市伦理委员会的批准。所有入选患者均签署知情同意书。入院的UAP患者参照2011年《ACC/AHA不稳定型心绞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》的UAP诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集入选患者外周静脉血2 mL加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4 ℃，100 r/min，15 min初步离心，离心后得到的上层液体于4 ℃，2 000 r/min，15 min再次离心，取得血浆4 ℃保存。

1.2.2 血浆miRNA的检测 分离血浆后用miRcute miRNA提取分离试剂盒(北京TIANGEN公司)分离提取血浆RNA并加尾、逆转录为cDNA，严格按照说明书进行操作。RNA加Poly(A)尾反应体系为：总 RNA 10.0 μL，E.coli Poly(A) 多聚酶(5 U/μL)0.4 μL,10×Poly(A)多聚酶缓冲液2.0 μL,5×rATP 溶液4.0 μL,无RNase ddH2O 3.6 μL，反应条件为37 ℃，60 min；逆转录合成cDNA的反应体系为：Poly(A)反应液2.0 μL,10×RT引物2.0 μL,10×RT缓冲液2.0 μL,dNTPs 1.0 μL,RNasin(40 U/μL)1.0 μL,Quant Rtase 0.5 μL,无RNase ddH20 11.5 μL，反应条件为37 ℃，60 min。荧光定量PCR(RT-qPCR)检测以miR-16作为内参，采用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(北京TIANGEN公司)，miR-16的上游引物为5′-GAT AGC AGC AGG TAA ACA TTG GCG-3′；miR-21的上游引物为5′-CGC CTA CCT TAT GAG ACT GAT GTT GAA-3′；miR-24的上游引物为5′-TGG CTC AGG TCA GCA GGA ACA G-3′；miR-126的上游引物为5′-CCT CGT TCC GTG AGT AAT AAT GCG-3′；miR-146的上游引物为5′-CGA TGA GAA CTG AAA TCC TTG GGT TA-3′;miR-223的上游引物为5′-TCC TGT CAG TCT GTC AAA TAC CCC A-3′；下游引物由试剂公司试剂盒提供。反应条件：94 ℃，2 min预变性，然后94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共45个循环，采集数据分析结果。依据上述RT-qPCR条件，对前期制备的各个样品的逆转录产物进行检测。以miR-16为内参[3-5]，计算3个复孔的平均值作为每个样品的实际Ct值，将同一样品的Ct值减去其内参Ct值，得到ΔCt值；即ΔCt=Ct目的-Ct内参基因；进行统计学分析，同时运用miRNA表达倍数的改变值(FC，即FC=2-ΔΔCt)对定量的结果进行分析和比较[6-7]。ΔΔCt=ΔCt处理样品-ΔCt对照样品。

2 结 果

2.1 研究对象各项化验指标的比较 冠状动脉病变阳性UAP患者与冠脉病变阴性UAP患者血细胞计数、血生化等差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1；A组与C组，B组与D组血细胞计数、血生化、Gensini评分等差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 研究对象检验指标及冠脉病情况的比较

PLT：血小板数量；MPV：平均血小板体积；PCT：血小板压积；PDW：血小板体积分布宽度；HGB:血红蛋白；WBC：白细胞；CHO：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；UA：尿酸；PT：凝血酶原时间；APTT：活化部分凝血酶原时间；Fib：纤维蛋白原；TT：凝血酶时间；INR;国际标准化比值；CRP：C-反应蛋白。

2.2 研究对象服药前后血浆miRNA的比较 样品的扩增曲线及溶解曲线提示样品提纯纯度较高，见图1、2。冠脉病变阴性UAP患者服阿司匹林前与服用阿司匹林1周后对比血浆miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。冠脉病变阳性UAP患者服阿司匹林前与服用阿司匹林1周后对比，血浆miR-223水平升高并差异有统计学意义(P<0.05)，而血浆miR-21、miR-24、miR-126及miR-146差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 UAP患者检验指标及冠脉病情况的比较

PLT：血小板数量；MPV：平均血小板体积；PCT：血小板压积；PDW：血小板体积分布宽度；HGB:血红蛋白；WBC：白细胞；CHO：总胆固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；ALT：谷丙转氨酶；AST：谷草转氨酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；UA：尿酸；PT：凝血酶原时间；APTT：部分凝血酶原时间；Fib：纤维蛋白原；TT：凝血酶时间；INR;国际标准化比值；CRP：C-反应蛋白。

图1 6对引物对样品的扩增曲线

2.3 各组血浆miRNA水平的比较C组与A组比较，血浆miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223水平均差异无统计学意义(P>0.05)。D组与B组比较，血浆miR-223水平升高并有统计学意义(P<0.05)，而血浆miR-21、miR-24、miR-126及miR-146表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

图2 6对引物的熔解曲线

项目冠脉病变阴性UAP患者用药前2-ΔCt用药后2-ΔCtP冠脉病变阳性UAP患者用药前2-ΔCt用药后2-ΔCtPmiR-210.275±0.0730.242±0.0850.1160.037±0.0070.039±0.0090.552miR-240.071±0.0200.067±0.0180.5050.023±0.0100.021±0.0150.864

续表3 服药前后患者血浆miRNA的比较

表4 UAP患者血浆miRNA水平的比较

3 讨 论

miR-21、miR-24、miR-126、miR-146及miR-223富含于不同的细胞中，同时它们也是血小板中水平较高的几种miRNA。它们与血管病变关系密切，缺氧时细胞内外的miRNA水平发生改变。既往多个试验发现冠心病及急性脑梗死时细胞内及血浆中的miR-126和miR-223水平下降，而动脉粥样斑块中的水平上升，推测其有稳定斑块的作用[6-7]。进而提出miR-126和miR-223可作为心脑血管病变的血浆标志物[8]。Long等[9]发现急性心肌梗死患者血浆中miR-126 和肌钙蛋白有相同的变化趋势，从而提出miR-126 和肌钙蛋白一样，可作为预测急性心肌梗死的生物学标记物。然而Sun等[10]研究了冠心病患者血浆miR-126与低密度脂蛋白(LDL)的关系，发现miR-126并不能区分冠心病与非冠心病患者，但它能通过调节脂质代谢从而影响冠心病的进程。尽管各个实验的结论不完全一致，但他们均未考虑到抗血小板药物对其细胞及血浆水平的影响。

最近的实验发现血小板也是血浆中miRNA的重要来源。血浆中的miRNA有41%～45%来源于血小板[11]。已知miR-223富含于造血干细胞和血小板中。它是血小板中水平最高的miRNA。Roberto等[12]发现miR-223的序列具有高度的保守性，提示其功能保守并在生物进化过程中具有重要的作用。已知miR-223可以调节细胞及血小板表面的黏附分子的表达，从而调节细胞及血小板的活性。血小板的P2Y12mRNA是miR-223的作用靶点[13]。前期试验发现动脉粥样硬化时血小板活性增高，血浆及细胞内miR-223的水平减少，血小板表面的黏附因子表达上调。阿司匹林作为一种抗血小板药物广泛应用于心脑血管疾病的预防及治疗。阿司匹林作用于环氧合酶(即前列腺素合成酶)减少血栓素A2(TXA2)的生成，从而抑制血小板的激活。本试验显示冠脉病粥样硬化血栓形成时服用阿司匹林可提高血浆miR-223的水平，这可能与阿司匹林抑制血小板的激活有关。而在冠状动脉病正常时，由于血小板处于相对平稳状态，故这一影响不明显。这提示miRNA在细胞活化时调节靶蛋白mRNA作用明显，而在细胞静止期这一作用较弱或无作用。同时本试验显示阿司匹林对血浆中其他几种miRNA的影响不大，考虑与其在血小板内水平偏低有关。鉴于阿司匹林在临床上的广泛应用，其对血浆miRNA水平的影响在确定血浆标志物时不得不慎重考虑。

[1]MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(30):10513-10518.

[2]ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[J].CellRes,2008,18(10):997-1006.

[3]ReidG,KirschnerMB,VanZandwijkN.CirculatingmicroRNAs:associationwithdiseaseandpotentialuseasbiomarkers[J].CritRevOncolHematol,2011,80(2):193-208.

[4]刘益民，杜鲁涛，王丽丽，等．膀胱癌患者血清microRNA检测中内参基因的筛选及验证[J]．山东大学学报(医学版)，2014，52(5)：86-91．

[5]SongJ,BaiZ,HanW,etal.IdentificationofsuitablereferencegenesforqPCRanalysisofserummicroRNAingastriccancerpatients[J].DigDisSci,2012,57(4):897-904.

[6]KinK,MiyagawaS,FukushimaS,etal.Tissue-andplasma-specificmicroRNAsignaturesforatheroscleroticabdominalaorticaneurysm[J].JAmHeartAssoc,2012,1(5):e000745.

[7]WangX,SundquistJ,ZöllerB,etal.Determinationof14circulatingmicroRNAsinSwedesandIraqiswithandwithoutdiabetesmellitustype2[J].PLoSOne,2014,9(1):e86792.

[8]FichtlschererS,DeRosaS,FoxH,etal.

Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease[J].Circ Res,2010,107(5):677-684.

[9]Long G,Wang F,Duan Q,et al.Human circulating microRNA-1 and microRNA-126 as potential novel indicators for acute myocardial infarction[J].Int J Biol Sci,2012,8(6):811-818.

[10]Sun X,Zhang M,Sanagawa A,et al.Circulating microRNA-126 in patients with coronary artery disease:correlation with LDL,cholesterol[J].Thromb J,2012,10(1):16.

[11]Diehl P,Fricke A,Sander L,et al.Microparticles:major transport vehicles for distinct microRNAs in circulation[J].Cardiovasc Res,2012,93(4):633-644.

[12]Roberto VP,Tiago DM,Gautvik K,et al.Evidence for the conservation of miR-223 in zebrafish (Danio rerio):implications for function[J].Gene,2015,566(1):54-62.

[13]Edelstein LC,Bray PF.microRNAs in platelet production and activation[J].Blood,2011,117(20):5289-5296.

The effect of aspirin on the expression of five miRNA in plasma of patients with unstable angina pectoris*

LiYun1,2,LvYunbo2,SongYinhong1△

(1.TheCollegeofMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China;2.DepartmentofCardiology,People′sHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

Objective To detect the effect of aspirin on the expression of miR-21,miR-24,miR-126,miR-146 and miR-223 in plasma of patients with unstable angina pectoris (UAP).Methods Fifteen UAP patients with coronary artery disease and ten UAP patients without coronary artery disease were selected as subjects.All subjects had no medication of aspirin before.Aspirin enteric-coated tablets was taken to all subjects at 0.1 g once a day orally for one week.The peripheral blood (PB) samples of the patients were collected before and after taking the drug for one week.The expressions of the 5 miRNAs in plasma were detected by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR).Meanwhile,fifty UAP patients with or without coronary artery disease were divided into the aspirin group and the control group according to the medication of aspirin.The expressions of the 5 miRNAs in plasma between different groups were compared.Results The expression of miR-223 in plasma of UAP patients with coronary artery disease was increased significantly after the medication of aspirin (P<0.05).However,the expression of the other 4 miRNAs in plasma of these UAP patients with coronary artery disease and the 5 miRNAs in plasma of the UAP patients without coronary artery disease did not change significantly before and after the medication of aspirin (P>0.05).Conclusion The medication of aspirin is able to increase the expression of miR-223 in serum of UAP patients with coronary artery disease but not of UAP patients without coronary artery disease.

aspirin;coronary artery disease;unstable angina pectoris;microRNAs

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.010

湖北省教育厅自然科学研究项目(Q20121306)。

李云(1977-)，主治医师，硕士，主要从事miRNA与心血管病方面研究。△

R541.4

A

1671-8348(2017)02-0178-04

2016-07-20

2016-09-08)