稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立*

邓常青，朱炳林，龙 艳，罗 伟，陈国俊△

(1.重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室，重庆 400016；2.重钢总医院重症医学科，重庆 400037)

论著·基础研究

稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立*

邓常青1,2，朱炳林1，龙 艳1，罗 伟1，陈国俊1△

(1.重庆医科大学附属第一医院神经病学重点实验室，重庆 400016；2.重钢总医院重症医学科，重庆 400037)

目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆，构建携带BACE1基因启动子的荧光素酶报告载体，筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性。方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA，以其为模板，PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中，构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1，将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照)，利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性。结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子，pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确；HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株，其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体。

β位点裂解酶-1；核心启动子；荧光素酶报告载体；高通量药物筛选

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种神经退行疾病，近年来其发病率不断增高。现有许多证据支持淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)的沉积是AD主要致病机制之一[1]。因此，减少Aβ沉积成为治疗AD的一条重要途径。β位点裂解酶-1(BACE1)是体内主要的β-分泌酶，是裂解淀粉样前体蛋白(APP)产生Aβ的限速酶。Aβ具有神经毒性，可引起神经突触功能障碍、神经元丢失，进而导致认知功能受损[2]。研究表明，在小鼠脑内注射BACE1的小干扰RNA可减轻APP转基因小鼠的Aβ沉积和提高认知功能[3-6]，这说明抑制BACE1表达会改善Aβ相关的认知功能障碍，因此β-分泌酶BACE1被作为开发AD药物的潜在靶点。

目前，BACE1基因单核苷酸多态性与AD发病是否相互作用尚未定论[7-8]，而针对BACE1分子的靶向治疗有望为治疗AD提供新思路，但对于BACE1分子的上游调控机制仍不清楚。为此本试验通过克隆人BACE1基因核心启动子区，构建荧光素酶报告系统并筛选其稳定表达细胞株，为进一步研究BACE1基因转录调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供有力工具。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肾HEK293细胞为本实验室保存；Phanta HS高保真DNA聚合酶购自Vazyme公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；无内毒素质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、荧光素酶报告质粒pGL4.21、荧光素酶检测试剂购自Promega公司；TRIzol、脂质体2000购自Invitrogen公司；DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；嘌呤霉素、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；感受态细胞DH5α购自北京鼎国公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。其余试剂为进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人基因组模板的制备 取对数生长期的HEK293细胞，采用TRIzol法[9]提取基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 人BACE1基因启动子的扩增 以基因组DNA为模板，采用 Phanta HS高保真DNA聚合酶以特异性引物扩增BACE1基因上游约758 bp的核心启动子(-691～+67)区，上游引物：5′-CTA GCT AGC CAG CCA TTT CTC CTC AGT CTG-3′，下游引物：5′-CCG CTC CTC GAG TCA GGC CAC CAT AAT CCA GCT-3′，下划线分别为NheI和XhoI酶切位点。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液3.0 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)，Phanta HS酶0.5 μL，基因组DNA 3.0 μL，加ddH2O补至30.0 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸7 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 BACE1基因启动子荧光素酶报告载体的构建 PCR产物和pGL4.21载体经NheI和XhoI双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接过夜并转化入DH5α感受态细胞，挑取2个氨苄青霉素筛选的阳性克隆。再经NheI和XhoI双酶切鉴定后送上海英骏公司测序，测序正确的命名为pGL4.21-BACE1，提取质粒后-20 ℃保存备用。

1.2.4 细胞培养及稳定表达株的筛选 HEK293细胞培养于含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素的 DMEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。将汇合度约80%的HEK293细胞以4×105接种6孔板，待细胞贴壁生长至约70%～80%汇合度时进行转染。用Opti-MEM培养基分别稀释载体pGL4.21-BACE1(每孔5 μg)和脂质体(每孔5 μL)(单独转染pGL4.21作为阴性对照组)，室温孵育5 min，载体和脂质体混合后室温孵育20 min，加入HEK293细胞中，37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染后48 h采用1 μg/mL浓度的嘌呤霉素筛选，筛选第14天时采用96孔板有限稀释法克隆化，待单细胞长满后转至24孔板继续培养，然后依次转至12孔板、6孔板及10 cm培养皿继续扩大培养(此过程2～3个月)。得到来自6株单克隆扩大培养的稳定表达细胞株，用化学发光仪检测其转录活性。选取荧光强度最高的进行后续试验并命名为HEK293/pGL4.21-BACE1(阴性对照组命名为HEK293/pGL4.21)。

1.2.5 荧光素酶活性测定 荧光素酶活性测定按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书进行操作。简单来说，将HEK293/pGL4.21-BACE1和HEK293/pGL4.21(阴性对照组)细胞以2×104接种96孔板(各3个重复孔)，培养24 h后每孔加与培养基等体积的Luciferase Reagent，轻轻混匀。室温裂解10 min后在化学发光仪Glomax 96(Promega)中测量萤火虫荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 BACE1基因启动子扩增产物的鉴定 提取HEK293细胞基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增BACE1基因上游长度758 bp的核心启动子(-691～+67)，PCR产物经1%琼脂糖电泳可见大小约758 bp的条带，与目的片段大小相符，见图1。

M:DNA相对分子质量标准; 泳道1～5:BACE1基因启动子。

图1 BACE1基因启动子的PCR扩增

2.2 荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1的构建与鉴定 758 bp的PCR产物与携带萤火虫荧光素酶基因的pGL4.21分别以NheI和XhoI双酶切，连接并转化DH5α后挑取2个阳性克隆子。经NheI和XhoI双酶切后可见大小约5 532 bp(pGL4.21)与758 bp(BACE1启动子)的2个片段出现(图2A)。测序验证也正确，这说明本研究成功构建携带BACE1启动子的荧光素酶报告载体，见图2B。

A:荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1的酶切鉴定；B:携带BACE1基因启动子的荧光素酶报告载体结构图。Luc2P:萤火虫荧光素酶基因；PSV40:SV40启动子；Puro:嘌呤霉素抗性基因；1:1号克隆子；2:2号克隆子。

图2 荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1的鉴定及结构图

2.3 构建稳定表达BACE1启动子的细胞系 pGL4.21-BACE1和阴性对照pGL4.21转染HEK293细胞(6孔板)后48 h，培养基中加入嘌呤霉素进行稳定筛选。培养第14天时采用有限稀释法克隆化，最后筛选得到6株单克隆稳定表达细胞株HEK293/pGL4.21-BACE1(克隆子1～6)。

2.4 稳定表达细胞株具有转录活性 本研究对筛选到的6株稳定表达细胞株进行荧光素酶活性检测(把阴性对照组HEK293/pGL4.21的荧光值看作1)。结果表明，克隆子1～6均具有较强的荧光活性，其荧光值分别为对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。其中，6号克隆子荧光活性最强，作为后续试验使用。

3 讨 论

BACE1是人体内唯一的β分泌酶，它能剪切APP生成Aβ，且在AD患者脑中，Aβ是淀粉样炎症斑的主要组成成分，Aβ沉积在AD的发生、发展中起着关键作用。抑制BACE1活性以降低Aβ生成成为治疗AD的靶点。目前对AD治疗的研究均致力于开发β-和γ-分泌酶抑制剂，以抑制Aβ的产生[10-13]，但是APP还可以被α-和γ-分泌酶裂解产生可溶性且具有神经营养和神经保护作用的sAPPα片段。所以非特异性地抑制γ-分泌酶会导致生理功能紊乱[14]。有报道称在AD发病过程中，Aβ随着BACE1的上调而增多，并与AD发病呈正相关[15]；用BACE1 siRNA处理神经干细胞后Aβ产生明显减少[6]。BACE1过表达或活性增强可能导致Aβ过度产生，最终诱导认知功能损伤。因此，针对BACE1的靶向治疗可能成为治疗AD的一种新途径[10-12]。因此，构建携带BACE1基因的荧光素酶报告载体来研究BACE1基因的调控和功能具有重要意义。

利用荧光素酶报告载体研究启动子对下游基因的调控，可以避免下游基因表达产物对启动子的干扰，能较好地反映外在因素对调控序列的影响。近年来，利用荧光素酶报告基因载体的药物筛选方法得到广泛应用。本试验通过克隆人BACE1基因核心启动子，构建萤火虫荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1，并成功筛选到6株稳定表达该启动子的HEK293细胞株。本研究构建的HEK293/pGL4.21-BACE1细胞株具有较强的转录活性，虽然比瞬时转染时的转录活性低1～2个数量级，但是稳定表达更利于药物的高通量筛选，减少了组间差异。

综上所述，本试验成功构建BACE1启动子驱动的荧光素酶报告载体，并筛选到了稳定表达细胞株，将为高通量药物筛选及进一步研究BACE1基因的转录调控提供重要的细胞学研究手段。

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Construction of HEK293 cell line stably expressing human BACE1 promoter and luciferase reporter gene*

DengChangqing1,2,ZhuBinglin1,LongYan1,LuoWei1,ChenGuojun1△

(1.KeyLaboratoryofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofIntensiveMedicine,ChonggangGeneralHospital,Chongqing400037,China)

Objective To clone human β-site APP cleaving enzyme (BACE1) gene core promoter for constructing luciferase reporter gene vector carrying BACE1 gene promoter and screening stable expression cell line,and to investigate its transcriptional activity.Methods The human embryo kidney HEK293 cell genome DNA was extracted as the template,BACE1 core promoter(-691～+67) was amplified by PCR,then was inserted into luciferase reporter vector pGL4.21.BACE1 gene promoter luciferase reporter vector pGL4.21-BACE1 was constructed,which was transfected into HEK293 cell (pGL4.21 vector without promoter as the negative control),after screening stable expression cell line by puromycin,the transcriptional activity was detected.Results About 758 bp BACE1 gene core promoter was successfully amplified by PCR.pGL4.21-BACE1 vector was correct by double enzyme identification.After transfecting HEK293 cell by this vector,6 cell strains stably expressing BACE1 promoter were obtained,and their transcriptional activities were (134.7±22.3),(634.0±13.9),(437.6±6.1),(805.5±5.5),(492.8±59.1),(1 021.1±46.6) times(P=0.001) of the control group(HEK293/pGL4.21) respectively.Conclusion Luciferase reporter vector of BACE1 gene promoter is constructed successfully.

β-site APP cleaving enzyme-1;core promoter;luciferase reporter gene vector;high-throughput drug screening

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.005

国家自然科学基金国际合作重大项目(81220108010)；国家自然科学基金 (81171197)；重庆市卫生局重点基金 (2011-1-018) 。 作者简介：邓常青(1980- )，主治医师，本科，主要从事阿尔茨海默病发病机制方面研究。△

Q291

A

1671-8348(2017)03-0302-03

2016-07-12

2016-10-06)