CyclinD1和Bax在甲状腺微小乳头状癌中的表达及意义*

魏广民，周文波△，武 伦，魏 英，张 睿

(湖北医药学院附属东风医院：1.肝胆胰甲状腺外科；2.实验中心；3.病理科，湖北十堰 442000)

论著·临床研究

CyclinD1和Bax在甲状腺微小乳头状癌中的表达及意义*

魏广民1，周文波1△，武 伦1，魏 英2，张 睿3

(湖北医药学院附属东风医院：1.肝胆胰甲状腺外科；2.实验中心；3.病理科，湖北十堰 442000)

目的 探究细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白在甲状腺微小乳头状癌中的表达及其价值。方法 选取2014年1月至2015年6月该院病理科存档的甲状腺疾病手术病例石蜡标本，应用免疫组织化学(MaxvisionTM/HRP免疫组织化学染色法)，以单克隆抗体兔抗人CyclinD1和鼠抗人Bax标记检测72例甲状腺微小乳头状癌、65例腺瘤组织和60例癌旁甲状腺正常组织，观察不同甲状腺组织中CyclinD1和Bax蛋白表达情况。结果 CyclinD1蛋白表达在甲状腺微小乳头状癌中的阳性率为79.17%，与腺瘤组织(χ2=14.730，P<0.01)、癌旁甲状腺正常组织(χ2=80.404，P<0.01)的表达差异有统计学意义，其与患者年龄、性别及淋巴结转移无明显关联(P>0.05)。Bax蛋白表达在甲状腺微小乳头状癌中的阳性率为66.67%，与腺瘤中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，与癌旁甲状腺正常组织的表达差异有统计学意义(P<0.01)，其与淋巴结转移有关联(χ2=4.598，P<0.05)，与患者年龄、性别无明显关联(P>0.05)。甲状腺微小乳头状癌中CyclinD1与Bax蛋白表达呈正相关关联(χ2=11.463，r=0.435，P<0.01)。结论 CyclinD1和Bax蛋白在甲状腺微小乳头状癌中高表达，与甲状腺微小乳头状癌的发生、发展相关，两者联合检测有助于对甲状腺微小乳头状癌的诊断。

甲状腺微小乳头状癌；cyclinD1；Bax；免疫组织化学

甲状腺肿瘤是内分泌系统肿瘤中较为多见的肿瘤之一，而甲状腺乳头状癌是最多见的甲状腺恶性肿瘤[1]，其发病率呈逐步升高的趋势[2]。直径小于或等于1 cm的甲状腺乳头状癌为甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroidmicrocarcinoma，PTMC)[3]。目前PTMC发病率约占甲状腺乳头状癌的50%[4]。临床上PTMC高肿瘤分期、甲状腺外转移、淋巴管侵袭及转移的病例较多。PTMC的发生、发展受多种癌基因、凋亡基因的调控。文献报道，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因与甲状腺肿瘤的出现有紧密关联[5]。细胞周期调控基因CyclinD1表达蛋白对G1期向S期转换有调控作用，其可致细胞增殖周期异常，从而导致肿瘤细胞凋亡受到抑制[6]。细胞凋亡存在于肿瘤发生、发展进程中，与肿瘤的生长密切相关[7]。Bcl-2相关X蛋白(Bax)是B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)基因家族中促凋亡基因的代表[8]。本试验研究甲状腺良恶性组织中Bax蛋白表达情况，以探索细胞凋亡所发挥的作用。PTMC细胞增殖与凋亡进程中，CyclinD1与Bax蛋白表达有无关联，值得探索。本文应用免疫组织化学技术，探究CyclinD1和Bax蛋白表达在甲状腺良、恶性肿瘤中发生、发展的意义，以及两者之间有无关联，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年6月在本院肝胆胰甲状腺外科治疗的甲状腺疾病手术病例(有完备病例材料的病理科存档蜡块)。PTMC 72例(甲状腺乳头状癌组)，其中颈部淋巴结转移8例；男25例，女47例；平均年龄(45.1±8.16)岁。良性肿瘤65例全数为甲状腺腺瘤(甲状腺腺瘤组)，其中男20例，女45例；平均年龄(52.3±11.75)岁。癌旁甲状腺正常组织60例(癌旁甲状腺正常组织组)，其中男18例，女42例；平均年龄(47.6±10.55)岁。全部病例标本均经手术和病理学证实。纳入标准：遵照PTMC的诊断标准肿瘤直径小于或等于1 cm；所选组织中均带有癌旁组织；术前无放化疗和免疫治疗病史。经病理检查确诊，72例PTMC未发现甲状腺癌浸润。标本遵照常例取材、固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 方法

1.2.1 试验试剂 即用型CyclinD1兔抗人单克隆抗体(克隆号SP4，产品编号RMA-0541),即用型Bax鼠抗人单克隆抗体(克隆号2D2，产品编号MAB-0254),EDTA抗原修复液(pH=9.0，产品编号MVS-0098/0099),即用型快捷免疫组织化学MaxvisionTM/HRP检测试剂盒(产品编号Kit-5030),二氨基联苯胺法(DAB)染色试剂盒(产品编号Kit-0016)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 试验方法 用免疫组织化学(MaxvisionTM/HRP免疫组织化学染色法)检测CyclinD1、Bax蛋白表达情况，严格遵照试剂盒说明书操作。具体操作步骤包括：(1)石蜡切片脱蜡、水化，自来水冲洗；(2)抗原EDTA热修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次3 min；(3)3%的双氧水孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；(4)去除PBS，切片上滴加第一抗体，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min；(5)去除PBS，切片上滴加MaxvisionTM/HRP试剂，室温孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min；(6)去除PBS，切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色；(7)自来水冲洗终止显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，PBS返蓝，切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。以PBS替换一抗作为阴性空白对照，以迈新生物公司提供的阳性对照切片做阳性对照。

1.2.3 试验判定标准 用已知阳性片作为阳性对照，PBS缓冲液替换一抗当作阴性对照。每一张切片选取有意义的10个高倍镜视野，每单个视野统计100个肿瘤细胞中的阳性细胞数量。由病理科两位医生用双盲的方法，对所有的片子进行观察。CyclinD1阳性指细胞核中呈现出淡黄、棕黄或棕褐色颗粒，不着色或着色浅且不特异者为(一)。以阳性细胞或阳性细胞数小于10%为(一)，以阳性细胞数大于或等于10%为(+)。Bax阳性指细胞膜和(或)细胞质中呈现出淡黄、棕黄或棕褐色颗粒，不着色或着色浅且不特异者为(一)。以阳性细胞或阳性细胞数小于10%为(一)，以阳性细胞数大于或等于10%为(+)。

1.3 统计学处理 运用SPSS 17.0软件对试验数据实行分析统计。应用χ2检验和Fisher精确概率法检验，同时应用Pearson列联系数分析阐明二者关联性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CyclinD1在甲状腺良、恶性组织中的蛋白表达 CyclinD1阳性表达部位定位于细胞核(图1)，其在甲状腺乳头状癌组、甲状腺腺瘤组、癌旁甲状腺正常组织组中阳性表达率为79.17%、47.69%、0%。甲状腺乳头状癌组CyclinD1蛋白表达高于甲状腺腺瘤组(χ2=14.730，P<0.01)、癌旁甲状腺正常组(χ2=80.404，P<0.01)；甲状腺腺瘤组CyclinD1蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组(χ2=35.538，P<0.01)，见表1。

2.2 Bax在甲状腺良、恶性组织中的蛋白表达 Bax阳性表达部位定位于胞膜和(或)细胞质(图1)，其在甲状腺乳头状癌组、甲状腺腺瘤组、癌旁甲状腺正常组织组中阳性表达率顺次为66.67%、52.31%、0%。甲状腺乳头状癌组Bax蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组(χ2=60.009，P<0.01)；甲状腺乳头状癌组Bax蛋白表达与甲状腺腺瘤组比较，表达差异无统计学意义(χ2=2.931，P>0.05)；甲状腺腺瘤组Bax蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组(χ2=40.510，P<0.01)，见表1。

2.3 PTMC中CyclinD1 、Bax蛋白表达与临床病理参数间的关系 CyclinD1蛋白的表达与患者性别、年龄、淋巴结转移无明显关联性(χ2=0.016、1.317、0.024，P>0.05)。Bax蛋白的表达与淋巴结转移的关联性差异有统计学意义(χ2=4.598，P<0.05)，与患者性别、年龄无明显关联性(χ2=1.961、10.113，P>0.05)，见表2。

2.4 PTMC中CyclinD1与Bax蛋白表达的相关性 PTMC中，Pearson分析检测得出CyclinD1和Bax蛋白表达呈正相关关联(P<0.01)，见表3。

A:Bax蛋白在PTMC中表达;B：CyclinD1蛋白在PTMC中表达;C:Bax蛋白在甲状腺腺瘤中表达;D:CyclinD1蛋白在甲状腺腺瘤中表达。

图1 MaxvisionTM/HRP免疫组织化学染色法(×200) 表1 CyclinD1和Bax蛋白在3组中表达

表2 PTMC中CyclinD1 、Bax蛋白表达与临床病理参数间的关系

表3 PTMC中CyclinD1与Bax蛋白表达的相关性分析

3 讨 论

环境与遗传中的致癌因素，以共同或者序贯的方式对细胞基因组DNA产生非致命的打击损伤。一定程度上DNA的损伤，能激活原癌基因和引起凋亡基因的异常表达，从而导致靶细胞产生紊乱变化。损伤基因组DNA未及时修复，突变基因积累可致细胞癌变[9]。原癌基因是细胞增生、分化的重要调控元件,如细胞周期调控蛋白CyclinD1[10]。CyclinD1是由CCNDI基因编码的原癌基因，基因定位于染色体11q13，全长约120 kbp，编码295个氨基酸构成的蛋白质，相对分子质量为34×103[11]。细胞周期调控蛋白CyclinD1通过与CDK4或CDK6结合形成CyclinD1-CDK4或CyclinD1-CDK6复合物,该复合物磷酸化关键底物Rb基因，Rb结合的转录因子E2F获得释放[12]，调控加速G1向S期转变的进程，增强DNA转录,致细胞周期缩短,细胞增殖速度加快[13]。

司海燕等[5]研究CyclinD1蛋白表达在甲状腺乳头状癌(79.2%)、甲状腺良性病变(27.5%)、正常甲状腺组织(0%)中的结果与本试验结果基本一致。 CyclinD1蛋白在甲状腺肿瘤组织中表达较强，提示甲状腺肿瘤组织较甲状腺正常组织的细胞增殖速度快。甲状腺乳头状癌组CyclinD1蛋白表达高于甲状腺腺瘤组、癌旁甲状腺正常组织组；甲状腺腺瘤组CyclinD1蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组，提示细胞增殖速度随着甲状腺组织恶性程度增加而增快。CyclinD1蛋白的表达与PTMC患者年龄、性别、淋巴结转移无明显关联性，张晓亮等[10]报道未发现CyclinD1蛋白与临床病理参数间的关系，与本试验结果基本一致，提示CyclinD1蛋白表达与PTMC的发生、发展密切相关。

肿瘤的出现，除去原癌基因的驱动,细胞凋亡基因的反常表达也有着关键性的作用。Bax基因是Bcl-2基因家族中的促凋亡基因，Bcl-2基因则抑制细胞凋亡。正常细胞内Bcl-2和Bax保持动态平衡，如Bcl-2基因表达蛋白相对增多，细胞处于存活状态；相反，Bax基因表达蛋白相对增多，细胞将要开启细胞凋亡闸门。细胞接受信号刺激后，Bax/Bcl-2的比值变化对细胞继续存活或者凋亡，起着关键性的作用[14]。(1)Bax蛋白将从细胞质迁徙到线粒体，以BH3结构域识别线粒体膜上Bcl-2蛋白，联系产生非同源二聚体，起抗凋亡的效用；(2)游离的Bax蛋白互相联系产生同源二聚体，并从胞液迁徙到线粒体膜上，插入线粒体外膜后并形成孔道，增加线粒体膜的渗透性，促进细胞色素C释放到细胞质，并开启细胞凋亡程序闸门，激活下游Caspase瀑布反应，最终致细胞凋亡[15]。因此，Bax基因是凋亡途径中的关键控件。

本试验蛋白阳性表达率与成克伦[16]报道Bax蛋白表达在甲状腺癌、甲状腺腺瘤中的结果基本一致。Bax蛋白在甲状腺肿瘤组织中表达较强，提示甲状腺肿瘤组织较甲状腺正常组织的细胞凋亡速度快。甲状腺乳头状癌组Bax蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组；甲状腺乳头状癌组Bax蛋白表达与甲状腺腺瘤组比较，表达差异无统计学意义(P>0.05)；甲状腺腺瘤组Bax蛋白表达高于癌旁甲状腺正常组织组。甲状腺乳头状癌组与甲状腺腺瘤组中Bax蛋白表达较强，且甲状腺乳头状癌组与甲状腺腺瘤组无明显差异，癌旁甲状腺正常组织组无表达；说明甲状腺乳头状癌组与甲状腺腺瘤组凋亡速度差异无明显，甲状腺肿瘤组织较甲状腺正常组织的细胞凋亡速度快。提示Bax蛋白表达与PTMC的发生、发展相关。Bax蛋白的表达与PTMC患者淋巴结转移有关联，与患者年龄、性别无明显关联性，提示Bax蛋白表达与PTMC的发生、发展、侵袭转移相关。

在PTMC中CyclinD1和Bax蛋白高表达，且CyclinD1和Bax蛋白表达呈正相关关联，提示两者可能共同参与PTMC的发生、发展进程。甲状腺肿瘤细胞生长到一定程度，其增殖和凋亡维持相对平衡，高度恶性肿瘤细胞增殖速度增快，其凋亡速度亦增快[17]。然而，CyclinD1和Bax基因的具体协同作用机制，目前还未阐明，需要下一步继续深入探究。

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Expression and significance of CyclinD1 and Bax in papillary thyroid microcarcinoma*

WeiGuangmin1,ZhouWenbo1△,WuLun1,WeiYing2,ZhangRui3

(1.DepartmentofLiverGallbladderPancreasThyoidSurgery;2.DepartmentofExperimentalCenter;3.DepartmentofPathology,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To explore the expression and value of CyclinD1 and Bax in papillary thyroid microcarcinoma.Methods The paraffin embedded specimens of thyroid diseases archived in the pathology department of our hospital from January 2014 to June 2015 were randomly selected.Expression of CyclinD1 and Bax were detected in 72 cases of papillary thyroid microcarcinoma,60 cases of paracancerous normal tissue and 65 cases of adenoma by using the monoclone antibody rabbit anti-CyclinD 1 and rat anti-Bax labeling.Results The positive rate of CyclinD1 protein expression in papillary thyroid microcarcinoma was 79.17%,the difference in the expression between adenoma tissue and paracancerous normal tissue was statistical significant (χ2=80.404,χ2=14.730,P<0.01),which had no obvious correlation with the patient′ s age,gender and lymph node metastasis(P>0.05).The positive rate of Bax protein expression in papillary thyroid microcarcinoma was 66.67%,its difference with adenoma was not obvious(P>0.05),but its difference with paracancerous normal tissue had statistical significance(P<0.01),which had correlation with lymph node metastasis(χ2=4.598，P<0.05),while had no obvious correlation with the patient′ s age and gender(P>0.05).The CyclinD1 expression in papillary thyroid microcarcinoma was positively correlated with the Bax protein expression (χ2=11.463,r=0.435,P<0.01).Conclusion CyclinD1 and Bax protein are highly expressed in papillary thyroid microcarcinoma,which is related with the occurrence and development of papillary thyroid microcarcinoma.Their combined detection is conducive to diagnose papillary thyroid microcarcinoma.

papillary thyroidmicrocarcinoma;Cyclind1;Bax;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.012

湖北省科学技术研究与开发项目(2014CFB310)；湖北省教育厅青年人才项目(Q20162112)。 作者简介：魏广民(1987-)，住院医师，在读硕士，主要从事肝胆胰甲状腺外科方面研究。△

R736.1

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1671-8348(2017)03-0325-04

2016-07-06

2016-09-30)