橄榄苦苷对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的保护效应*

胡光强,袁 园,杜 曦,李永杰,余 录△

(西南医科大学：1.基础医学院;2.药物与功能性食品研究中心，四川泸州 646000)

论著·基础研究

橄榄苦苷对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的保护效应*

胡光强1,袁 园1,杜 曦1,李永杰2,余 录1△

(西南医科大学：1.基础医学院;2.药物与功能性食品研究中心，四川泸州 646000)

目的 观察橄榄苦苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 雄性ICR小鼠被分为正常对照组、LPS组、橄榄苦苷低剂量组(15 mg/kg),橄榄苦苷中剂量组(30 mg/kg)，橄榄苦苷高剂量组(45 mg/kg)及甘利欣组(甘草酸二铵注射液，11.25 mg/kg)。LPS(10 mg/kg)腹腔注射制作急性肝损伤模型，橄榄苦苷及甘利欣均于LPS注射后1 h和3 h尾静脉给予，正常对照组给予等量的生理盐水。6 h后处死所有小鼠，用称质量法计算肝脏指数，苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理学变化，免疫组织化学染色法检测肝组织肿瘤坏死因子(TNF-α)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。结果 肝脏指数：橄榄苦苷高剂量组、中剂量组及甘利欣组较LPS组明显降低(P<0.05)；染色结果：高剂量和中剂量的橄榄苦苷及甘利欣组减轻LPS诱导的小鼠肝脏病理学损伤程度。与LPS组比较，橄榄苦苷高剂量组、中剂量组及甘利欣组TNF-α和ICAM-1的表达显著下调(P<0.05)。结论 橄榄苦苷对LPS所致的小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用,其机制可能与阻止肝脏炎性反应有关。

橄榄；肝脏；创伤和损伤；急性病；脂多糖类；急性肝损伤；橄榄苦苷

肝脏是人体最大的消化腺，是体内新陈代谢的核心场所，也是内毒素最易致损的靶器官之一。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，其主要成分脂多糖(lipopolysacchide,LPS)在肝脏疾病的发生、发展过程中起着至关重要的作用[1]。橄榄苦苷，一种在橄榄叶中含量极高并易于分离纯化的生物活性物质，具有消炎、抗病毒、防癌等多种药理学效应[2]。本实验采用LPS腹腔注射致小鼠急性肝脏炎症模型，观察橄榄苦苷的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性ICR小鼠，体质量25～30 g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器 橄榄苦苷由成都曼斯特生物科技有限公司提供，纯度：高效液相色谱法(HPLC)≥98%；LPS(from Escherichia coli 0111:B4，Sigma公司)；甘利欣注射液购自江苏正大天晴药业股份有限公司；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。仪器还有梅特勒LE104E电子天平(梅特勒托利多，瑞士)，奥林巴斯BX60显微镜(奥林巴斯，日本)，Leica CM 1950冰冻切片机(徕卡公司，德国)及Image-pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics，美国)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及动物模型制作 小鼠分为正常对照组、LPS组、橄榄苦苷低剂量组(15 mg/kg)，橄榄苦苷中剂量组(30 mg/kg)，橄榄苦苷高剂量组(45 mg/kg)及甘利欣组。甘利欣组以11.25 mg/kg的剂量给药(按成人用药量换算成小鼠等效剂量)，每组13只。LPS(10 mg/kg)腹腔注射给予，橄榄苦苷和甘利欣于LPS注射后1、3 h尾静脉注射给予，正常对照组及LPS组给予等量生理盐水。

1.2.2 肝脏指数检测 LPS注射后6 h,每组8只小鼠麻醉后处死，取肝脏用滤纸将表面吸干，电子分析天平称其湿质量，计算肝脏指数。肝脏指数=肝湿质量/体质量×100%。

1.2.3 组织病理学观察 将小鼠麻醉后，分别用冰冻磷酸盐缓冲液(PBS)和多聚甲醛灌流，取肝脏右侧中叶同一部位甲醛固定24 h，置于15%的蔗糖溶液中过夜，次日标本沉底后，换30%的蔗糖溶液浸泡，4 ℃冰箱保存，择日用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋、冰冻切片，用于苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。

1.2.4 HE染色 切片置于50 ℃烤箱4 h,蒸馏水洗5 min，3次，然后苏木素染色2 min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化1～3 s，蒸馏水洗5 min×3次，伊红液染色1～3 min，蒸馏水稍洗后80%、95%乙醇及无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，烤干后封片。400倍光镜下取肝组织同一区域3个不同的视野采图，观察肝脏病理学改变情况。

1.2.5 免疫组织化学染色 切片用蒸馏水洗5 min×3次，3%H2O2甲醇液避光孵育20 min，蒸馏水清洗，枸橼酸缓冲液微波抗原修复，冷却后pH7.2的PBS洗5 min×3次，滴加牛血清清蛋白(BSA)，于37 ℃孵育40 min，甩干后滴加稀释的一抗(TNF-α 1∶100；ICAM-1 1∶200)于湿盒内4 ℃过夜，次日取出后置于室温1 h。PBS冲洗，加羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育1 h，SABC孵育1 h，然后DAB显色，苏木素复染，脱水、透明及封片。400倍光镜下取肝组织同一区域3个不同的视野采图，记录每高倍视野TNF-α阳性表达数，用Image proplus 6.0软件计算ICAM阳性表达的累积光密度值(IOD)与面积的比值。

2 结 果

2.1 橄榄苦苷对LPS诱导的ICR小鼠肝脏指数的影响 正常对照组小鼠肝指数为(4.72±0.35)%，LPS组小鼠肝脏指数明显升高，为(5.38±0.38)%，两组比较，肝脏指数差异有统计学意义(P<0.01)。而橄榄苦苷高剂量组肝脏指数为(4.84±0.21)%，甘利欣组肝脏指数为(4.86±0.20)%，两组较LPS组小鼠肝脏指数均有明显降低(P<0.01)。橄榄苦苷中剂量肝脏指数为(4.98±0.34)%，较LPS组也有降低(P<0.05)；低剂量橄榄苦苷组肝脏指数为(5.25±0.39)%，虽然有所降低，但与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 橄榄苦苷对LPS诱导的ICR小鼠肝脏组织病理学检查的影响 在400倍光镜下，正常对照组小鼠肝细胞结构清晰，细胞间间隙紧密均匀，未见细胞水肿、变性坏死等病理现象；LPS组小鼠肝脏中央静脉扩张，肝细胞肿胀、空泡变性，个别肝细胞出现坏死，细胞间间隙变宽、排列紊乱；橄榄苦苷中剂量和高剂量组较LPS组肝细胞炎性水肿程度减轻，细胞间间隙变紧密,排列相对均匀；甘利欣组病理现象也有明显改善；而橄榄苦苷低剂量组对LPS导致的肝脏病理损伤没有明显改善，见图1。

2.3 橄榄苦苷对LPS诱导的ICR小鼠肝脏组织TNF-α和ICAM-1表达的影响 正常对照组肝脏几乎没有TNF-α阳性表达，但在LPS诱导组，大鼠肝细胞质可见大量棕褐色TNF-α阳性颗粒表达，肝细胞呈深染色。橄榄苦苷各组TNF-α阳性颗粒较LPS组表达呈剂量依赖性减少(P<0.05)；甘利欣组TNF-α阳性表达数量也明显减少，且肝细胞染色变浅，与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。另外，正常对照组肝脏仅有极少ICAM-1阳性表达，但LPS组可见明显的ICAM-1棕黄色强阳性表达，其表达主要出现在肝窦内皮细胞、肝实质细胞；橄榄苦苷高剂量和中剂量组中ICAM-1阳性表达减少，仅有肝窦内皮细胞可见，且染色程度减轻；甘利欣组肝组织ICAM-1阳性表达也明显减轻。统计学结果表明，橄榄苦苷中、高剂量组及甘利欣组小鼠ICAM-1阳性细胞表达的IOD与面积比值与LPS组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图3。

A:正常对照组；B:LPS组；C：橄榄苦苷低剂量组；D:橄榄苦苷中剂量组；E:橄榄苦苷高剂量组；F:甘利欣组。

图1 橄榄苦苷对LPS诱导的ICR小鼠肝脏组织病理学检查的影响(HE，×400)

A:正常对照组；B:LPS组；C：橄榄苦苷低剂量组；D:橄榄苦苷中剂量组；E:橄榄苦苷高剂量组；F:甘利欣组。

图2 各组小鼠肝脏组织TNF-α表达(免疫组织化学，×400)

A:正常对照组；B:LPS组；C：橄榄苦苷低剂量组；D:橄榄苦苷中剂量组；E:橄榄苦苷高剂量组；F:甘利欣组。

图3 各组小鼠肝脏组织ICAM-1的表达(免疫组织化学，×400) 表1 橄榄苦苷对LPS诱导的ICR小鼠肝脏组织 TNF-α和ICAM-1表达的影响

a：P<0.05，b：P<0.01,与LPS组比较。

3 讨 论

肝脏是人体非常重要的器官，承担着解毒、代谢及免疫防御等功能[3]。在病毒或内毒素刺激的情况下，肝脏细胞特别是Kupeff细胞及肝窦内皮细胞大量增殖，合成并释放炎性细胞因子、细胞黏附分子，参与白细胞-肝窦内皮细胞间的黏附和跨内皮迁移，进一步促进炎性反应的病理过程，从而加重肝损伤[4]。研究表明，LPS与细胞膜上的受体结合后，激活肝内外单核-巨噬细胞系统,通过其上调核因子κB(NF-κB)、P38及JAK/STAT等炎性信号通路,增加致炎因子的表达，形成瀑布级联效应从而损伤肝脏[5-7]。

众所周知，橄榄油因具有强大的抗氧化作用而广泛运用于美容、医疗界。而随着研究的不断深入与发展，橄榄苦苷作为橄榄叶中含量较多的苯酚类裂环环烯醚帖苷化合物，其具有无毒、易被人体吸收等优势，其药理学效应也逐渐被重视[8]。有研究表明，橄榄苦苷对HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的表达呈剂量依赖性抑制作用，且体内研究表明其具有抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV-DNA)的作用，但其作用机制尚未明确[9]。这为橄榄苦苷在肝脏疾病的治疗研究提供了契机。

本研究以LPS为诱导制作肝脏急性损伤模型，观察橄榄苦苷的保护作用。结果发现，腹腔注射LPS导致肝脏的炎性水肿、空泡变性等病理损伤，且肝脏指数明显升高，说明LPS成功诱导了肝脏急性损伤。进一步研究发现，模型组也显示作为炎性标志的TNF-α和ICAM-1在肝脏组织中有较高的表达，说明LPS增加了致炎因子的表达，从而导致了病理改变。临床研究证实，肝炎患者血清中往往存在高水平TNF-α、ICAM-1表达，而且，在慢性肝病中，ICAM-1在肝组织和血清中表达呈相关性增强[10]，这与本研究结果契合。而本研究给予中剂量和高剂量的橄榄苦苷，不仅在一定程度上减轻了LPS导致的肝脏病理损伤程度，且肝脏组织切片TNF-α、ICAM-1的阳性表达也有明显的下调，说明橄榄苦苷对LPS导致的肝损伤有一定的保护效应，其作用可能是通过抑制炎性因子及黏附分子的表达，阻止炎症瀑布级联反应，但更深的机制还需进一步的研究。

[1]Oh IS,Park SH.Immune-mediated liver injury in hepatitis B virus infection[J].Immune Netw,2015,15(4):191-198.

[2]陈碧琼，聂咏飞，涂华．中药青果的化学成分及药理作用研究进展[J]．广州化工，2012，40(21)：16-18．

[3]Chisari FV,Isogawa M,Wieland SF.Pathogenesis of hepatitis B virus infection[J].Pathol Biol(Paris),2010,58(4):258-266.

[4]胡泽华，王琳琳．内毒素血症肝损伤机制的研究进展[J]．医学综述，2009，15(7)：1047-1050．

[5]Chen W,Lin YJ,Zhou XY,et al.Protective effect of Salvia miltiorrhiza and Carthamus tinctorius extract against lipopolysaccharide-induced liver injury[J].World J Gastroenterol,2015,21(30):9079-9092.

[6]Tang J,Li L,Li CM,et al.Upregulation of HO-1 with haemin alleviates LPS-stimulated pro-inflammatory responses through downregulation of p38 signalling pathways in rat liver[J].Scand J Immunol,2015,82(5):443-451.

[7]Lv X,Zhang Y,Cui Y,et al.Inhibition of microRNA 155 relieves sepsis induced liver injury through inactivating the JAK/STAT pathway[J].Mol Med Rep,2015,12(4):6013-6018.

[8]Tan HW,Tuck KL,Stupans I,et al.Simultaneous determination of oleuropein and hydroxytyrosol in rat plasma using liquid chromatography with fluorescence detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2003,785(1):187-191.

[9]Zhao G,Yin Z,Dong J.Antiviral efficacy against hepatitis B virus replication of oleuropein isolated from Jasminum officinale L.var.grandiflorum[J].J Ethnopharmacol,2009,125(2):265-268.

[10]章幼奕，秦刚，姚建国，等．慢性病毒性肝炎患者血清sICAM-1与肝组织病理变化的相关性研究[J]．实用肝脏病杂志，2008，11(3)：159-162．

Protective effects of oleuropein on acute liver injury induced by lipopolysacchide in mice*

HuGuangqiang1,YuanYuan1,DuXi1,LiYongjie2,YuLu1△

(1.CollegeofBasicMedicine;2.ResearchCenterofDrugsandFunctionalFoods,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the protective effects of oleuropein on actue liver injury induced by lipopolysacchide(LPS) in mice.Methods Male ICR mice were divided into the normal control group,LPS group,oleuropein high dose(45 mg/kg),medium dose (30 mg/kg) and low(15 mg/kg) dose groups and Ganlixin (glycyrrhizic acid diammonium injection,11.25 mg/kg) group.Mice were intraperitoneally injected with LPS(10 mg/kg) to establish the model of liver injury,then mice were intravenously given oleuropein and Ganlixin by tail vein at 1,3 h after LPS injection.Subsequently,all mice were sacrificed at 6 h,the liver index was calculated by weighing method,the pathologic changes were observed by HE staining,and the expressions of TNF-α and ICAM-1 were detected by immunohistochemical techniques.Results The liver index:compared with the LPS group,the liver index in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly decreased (P<0.05);the staining results：the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group reduced the liver pathology damage degree induced by LPS;the expression of TNF-α and ICAM-1 in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly down-regulated compared with the LPS group (P<0.05).Conclusion Oleuropein has remarkable protective effect on mice acute liver injury induced by LPS,its mechanism may be associated with blocking the liver inflammatory reaction.

canarium album;liver;wounds and injuries;acute disease;lipopolysaccharides;acute liver injury;oleuropein

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.008

省-市-校联合基金项目(14JC0120)；四川省教育厅基金项目(14ZB0152)。 作者简介:胡光强(1970-)，副教授，本科，主要从事神经解剖学方面研究。△

R575；R966

A

1671-8348(2017)03-0312-03

2016-07-26

2016-10-22)