黑荞麦中花青素的提取及含量测定

陈长应，朱桂红

(江苏省徐州医药高等职业学校,江苏 徐州 221116 )



黑荞麦中花青素的提取及含量测定

陈长应，朱桂红

(江苏省徐州医药高等职业学校,江苏 徐州 221116 )

建立了一种用微波提取黑荞麦中花青素，并用高效液相色谱法测定其含量的方法。以体积分数60%乙醇为萃取溶剂、料液比为1∶15、温度为60℃，微波萃取15 min；以Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氢钾(用磷酸调节pH=3.0)(80∶20)为流动相，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl进行检测。黑荞麦中花青素含量在0.04～0.28 mg/ml,回归方程具有良好的线性关系，精密度为RSD=0.76%，回收率为99.0%～100.2%。该方法简便快速，结果重现性好，定量准确，准确度、精密度高，适用于黑荞麦中花青素的含量测定。

微波萃取；HPLC；黑荞麦；花青素

古代医学《本草纲目》记载：苦荞麦味苦、性平寒，有“实肠胃，益气力，续精神，利耳目”的作用，能练五脏滓秽，降气宽肠，磨积滞，消热肿风痛。苦荞麦中含有丰富的花青素，现代临床医学观察表明，花青素具有降血糖、降血脂，增强人体免疫力、疗胃疾、除湿解毒、治肾炎、蚀体内恶肉的功效，对糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、中风、胃病患者都有辅助治疗作用[1-2]。目前，对花青素的测定方法比较多，主要有比色法和高效液相色谱法，比色法虽然较简单，但精确度和准确率不高；高效液相色谱法准确率较高，但精确度不太高[3-4]。虽然有关植物中花青素含量研究较多，但对黑荞麦中花青素含量的测定研究较少，因此，我们研究微波法快速提取黑荞麦中花青素，再用高效液相色谱法测定其含量。结果表明，该方法快速，准确度高，重现性好，可操作性强，适宜于黑荞麦中花青素含量的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：LC-20AT高效液相色谱仪,SPD-20A紫外-可见检测器,TP150超声波清洗机,GM-0.33II真空泵(无油),MEL-204E电子分析天平,1 000 ml溶剂过滤器,HL-28多功能食品粉碎机,WTS03-1微波提取器。

试剂：甲醇,HPLC 级;磷酸二氢钾,分析纯;乙醇、乙醚、石油醚、二氯甲烷、三卤甲烷、丙酮、乙腈,分析纯；纯净水；纯品原花青素。

1.2 溶液的配制

1.2.1 黑荞麦样品处理

黑荞麦购于超市，洗净晾干，烘干，粉碎机粉碎，过40目筛后，装瓶备用。

1.2.2 黑荞麦样品溶液的配制

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，按一定的料液比加入溶剂，通电，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，取上清液，用0.45 μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于100 ml 容量瓶中，备用[5]。

1.2.3 对照品溶液的制备

常温下，精确称取原花青素对照品0.010 0 g，于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶液，定容于10 ml，摇匀，得到1 mg/ml原花青素对照品溶液。用0.45 μm 针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于10 ml 容量瓶中备用。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：室温；紫外-可见检测器及波长：520 nm，流动相:甲醇(0.02 mol/L)-磷酸二氢钾(用磷酸调节pH=3.0)(80∶20)，流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。在上述色谱条件下，花青素的保留时间约为4.5 min。

2 结果与分析

2.1 微波萃取条件的选择

2.1.1 萃取溶剂的选择

萃取溶剂是影响萃取效率的决定性因素。为了确定合适的萃取溶剂，选用图中几种常见溶剂作为提取溶剂[6-7]，对黑荞麦中的花青素进行微波辅助萃取，每种溶剂测定2次，结果见图1。

图1 不同溶剂的萃取效果

从图1可知，二氯甲烷的萃取效果最好，乙醇次之，但考虑到二氯甲烷对流动相有侵蚀的影响，因此,本试验选择乙醇为萃取溶剂。

2.1.2 乙醇体积分数的选择

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，分别加入体积分数40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，料液比为1∶15，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，HPLC分析，结果见图2。由图2可知，花青素含量随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，在乙醇体积分数为60%时，含量达到最高。这是因为一方面乙醇体积分数的增大有利于有效成分的溶解，使得花青素提取率逐渐升高；但另一方面乙醇体积分数过大，使得体系的极性降低，不利于有效成分的浸出，含量降低。因此，选择作为萃取溶剂乙醇的体积分数为60%。

图2 乙醇体积分数对花青素提取的影响

2.1.3 萃取时间的选择

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，加入60%的乙醇溶液，料液比为1∶15，分别在5、10、15、20、25、30 min微波萃取，冷却室温后，HPLC分析，结果见图3。随着萃取时间延长，提取率越高，在15 min时达到最高值并逐渐平稳，因此，选择微波萃取时间15 min为宜。

图3 萃取时间对花青素提取的影响

2.1.4 料液比的选择

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，加入 60%的乙醇溶液，分别在料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30情况下微波萃取15 min，冷却室温后，HPLC分析，结果见图4。根据测定结果，料液比为1∶15时，提取率高。因此，选择料液比为1∶15。

图4 料液比对花青素提取的影响

2.1.5 萃取温度的选择

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，加入 60%的乙醇溶液，料液比为1∶15，分别在40、50、60、70、80、90℃下，微波萃取15 min，冷却室温后，HPLC分析。试验结果表明，温度升高，花青素提取率增大，但是温度超过60℃后，提取率反而降低。温度升高，有利于样品中的花青素扩散到溶剂中，所以温度升高提取率升高，但温度高于60℃后，已超过乙醇的沸点，大部分乙醇以气态存在，溶解花青素的能力下降，也可能是因为当温度达到一定时，花青素发生分解或异构变成其他物质，最终导致花青素提取率下降，综合考虑，最佳提取温度应在60℃[8-9]。结果如图5所示。

图5 萃取温度对花青素提取的影响

2.2 流动相的选择

在色谱条件的优化中，在流动相的选择上，分别考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙睛-水、乙睛-磷酸四种流动相。经过试验：甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氢钾(用磷酸调节pH=3.0)(70∶30)作为流动相时分离效果最好，分离度达到2.256。流动相中，用磷酸将溶液调为酸性，可以改善分离度和防止峰的拖尾，并使出峰时间提前，但对保持柱的稳定性和延长柱的寿命有一定的影响[10]。

2.3 标准曲线的绘制

准确移取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml标准品储备液(1 mg/ml)于10 ml 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，进行HPLC分析。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制得标准曲线，如图6所示。

图6 花青素标准曲线

计算出标准曲线的回归方程为:A=1.596×107C+1.198×104，r=0.999 8。结果表明，该方法分离效果良好，质量浓度在0.04～0.28 mg/ml时与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 样品测定

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，加入 60%的乙醇溶液，料液比为1∶15，通电，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，取澄清滤液，用0.45 μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于100 ml容量瓶中，精密吸取样品溶液 5 ml，于100 ml容量瓶中，加入加流动相稀释至刻度，摇匀，每次取 10 μl， 平行5次，注入色谱仪，按1.2.4节方法中的色谱条件，记录色谱图，根据图中的峰面积，代入回归方程，测得样品中花青素的含量为0.215 mg/ml。测定结果如图7所示，色谱图见图8、图9。

图7 样品含量测定结果

图8 花青素标准色谱图

图9 样品色谱图

2.5 精密度试验

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，按1∶15的料液比加入溶剂，通电，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，取澄清滤液，用0.45 μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于 100 ml 容量瓶中，精密吸取样品溶液 5 ml，于 100 ml 容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，量取样品溶液10 μl，按1.2.4节方法中的色谱条件，重复进样6次，记录峰面积，根据峰面积计算黑荞麦中花青素的含量。结果如图10所示，RSD=0.76%(n=6)，表明仪器精密度良好。

图10 样品精密度测定结果

2.6 回收率试验

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，按1∶15的料液比加入溶剂，通电，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，取澄清滤液，用0.45 μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于 100 ml 容量瓶中，备用。

精密量取上述样品溶液5 ml，6份，放入6个100 ml容量瓶中，再分别精密量取已知含量的标准溶液(1 mg/ml) 5 ml，6 份，放入上述6个100 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别取10 μl，按照1.2.4节方法，注入色谱仪，记录色谱图，根据峰面积计算黑荞麦中花青素的含量。测定结果如表1、图11所示，回收率为99.0%～100.2%，RSD为0.95%。

表1 加标回收试验结果

图11 样品回收率测定结果

2.7 稳定性试验

称取100 g黑荞麦粉，置于微波萃取器中，在60℃时，按1∶15的料液比加入溶剂，通电，微波萃取15 min，取出，冷却室温后，取澄清滤液，用0.45 μm针筒式滤膜过滤器过滤，滤液于100 ml容量瓶中，精密吸取样品溶液5 ml，于100 ml容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，量取样品溶液10 μl，按照1.2.4节方法，注入色谱仪，在0、24、48、72、96 h记录色谱图，记录峰面积，算出RSD值，计算结果是RSD为0.53%，表明样品溶液中花青素在96 h内稳定。结果如表2所示。

表2 稳定性试验结果

2.8 重复性试验

精密吸取样品溶液 5 ml，于 100 ml 容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，量取样品溶液10 μl，按照1.2.4节方法，注入色谱仪，平行6次，测定黑荞麦中花青素的含量。结果是RSD=0.73%(n=6)，表明本方法重复性良好，详见表3。

表3 重复性试验结果

3 结论

本试验选择体积分数60%乙醇为萃取溶剂、料液比为1∶15、温度为60℃、微波萃取15 min的优化条件，对黑荞麦中的花青素进行萃取，以Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，甲醇(0.02 mol/L )-磷酸二氢钾(用磷酸调节pH=3.0)(80∶20)为流动相，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl进行检测。结果表明，在 0.04～0.28 mg/ml具有良好的线性关系，精密度RSD=0.76%(n=6)，回收率为99.0%～100.2%。该方法简便快速，结果重现性好，定量准确，准确度、精密度高，适用于黑荞麦中花青素的含量测定。

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(责任编辑：赵琳琳)

Extraction and content determination of anthocyanins in black buckwheat

CHEN Chang-ying，ZHU Gui-hong

(Jiangsu Xuzhou High Medical Vocational School, Xuzhou 221116,China)

We established a method of microwave extraction of anthocyanins in black buckwheat and content determination by HPLC.With 60%(v/v) ethanol as extraction solvent, solid-liquid ratio of 1∶15, temperature of 60℃, microwave extraction for 15 min,chromatographic column Shim-pack-vp-ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm),mobile phase of methanol (0.02 mol/L) -potassium dihydrogen phosphate (with phosphoric acid to adjust pH = 3.0) (80∶20),the flow rate was 1.0 ml/min,and sample quantity was 10 μl. The results showed that: in the range of 0.04-0.28 mg/ml, the regression equation had good linear relationship, precision was 0.76%, the recovery was 99.0%-100.2% .The method was simple and rapid, good reproducibility and quantitative accuracy,high accuracy and precision, as a result, suitable for determination the content of anthocyanin in black buckwheat.

microwave extraction; HPLC; black buckwheat; anthocyanins

2016-06-02;

2017-01-01

陈长应(1965-)，男，副教授，硕士，从事化学教学工作。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.015

S517;O657.7+2

A

1003-6202(2017)01-0064-05